毛冬青相關(guān)有效成分篩選及其抑制磷酸二酯酶活性的研究.pdf

1、目的:
　　磷酸二酯酶(PDEs)具有水解細(xì)胞內(nèi)第二信使環(huán)磷酸腺苷（cAMP）或環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)的功能，從而終結(jié)這些第二信使所傳導(dǎo)的生化作用。11種PDE酶家族中的7種PDE酶，已被發(fā)現(xiàn)在心臟組織中表達(dá)，提示PDE酶在心血管系統(tǒng)病生理過(guò)程中的重要作用。近年來(lái)，PDE酶作為新的心血管疾病治療靶點(diǎn)，成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。毛冬青作為一個(gè)常用中藥，具有活血通脈、消腫止痛、清熱解毒等功效，在冠心病、心絞痛和脈管炎等疾病治療方面應(yīng)用廣泛

2、。課題組在前期的研究中，發(fā)現(xiàn)毛冬青對(duì)心血管疾病特別是心衰方面有著良好的藥理作用，也有文獻(xiàn)表明毛冬青甲素具有PDE酶的抑制活性，然而毛冬青藥材的作用基礎(chǔ)和可能的靶點(diǎn)等尚未有較系統(tǒng)的揭露。
　　本文旨在建立一種聯(lián)合應(yīng)用超濾技術(shù)和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的快速篩選方法，對(duì)毛冬青中潛在的PDE酶抑制成分進(jìn)行研究，探討毛冬青對(duì)心血管疾病藥理作用的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.毛冬青根中主要成分的LC-MS分離與鑒定
　　毛冬青根粉碎

3、至80目，以80％甲醇超聲提取，提取物溶液在高效液相色譜儀中，以乙腈-0.1％甲酸水的流動(dòng)相體系進(jìn)行梯度洗脫分離，二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)后，在線聯(lián)用電噴霧離子-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，將所得的色譜和質(zhì)譜行為數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照，并對(duì)相應(yīng)的多級(jí)質(zhì)譜碎片進(jìn)行質(zhì)譜裂解分析，得到初步的化合物結(jié)構(gòu)解析結(jié)果，部分化合物進(jìn)一步與標(biāo)準(zhǔn)品的色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜行為數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)照，驗(yàn)證結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果。
　　2.毛冬青根中4種綠原酸類和4中皂苷類成分的含量測(cè)

4、定
　　毛冬青根粉碎至80目，以80％甲醇超聲提取，提取物定容為0.05 g·mL-1（以生藥計(jì)）的供試品溶液。精密稱取各對(duì)照品，分別加入甲醇配制成含如下濃度的對(duì)照品溶液，綠原酸12.5μg·mL-1，異綠原酸B29.6μg·mL-1，異綠原酸A30.0μg·mL-1，異綠原酸C34.5μg·mL-1，毛冬青皂苷B1169.5μg·mL-1，毛冬青皂苷B2130.5μg·mL-1，毛冬青皂苷A1324.0μ g·mL-1，冬青素A

5、728.0μg·mL-1，按比例稀釋，繪制各化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)照品和供試品在相同的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以混合對(duì)照品溶液進(jìn)行方法學(xué)考察，包括精密度、定量限、檢測(cè)限等，并對(duì)樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，最后測(cè)定得到各化合物成分在毛冬青根中的含量。
　　3.毛冬青根中與PDEⅠ酶結(jié)合成分的LC-MS分析
　　制備濃度為0.1 g·mL-1（以生藥計(jì)）的毛冬青根提取物溶液，與20 U·mL-1的PDEⅠ酶溶液進(jìn)行孵育，置于容量4 mL截留

6、分子量為10 kDa的超濾管中進(jìn)行分離，分離后超濾內(nèi)管的藥物-蛋白復(fù)合物以50％甲醇洗脫，收集并以氮?dú)獯蹈?，定容后進(jìn)行高效液相-二極管陣列檢測(cè)器-電噴霧離子-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀聯(lián)用進(jìn)行分析，將所得的的色譜和質(zhì)譜行為數(shù)據(jù)與毛冬青根提取物的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)照，并對(duì)相應(yīng)的多級(jí)質(zhì)譜碎片進(jìn)行質(zhì)譜裂解分析，得到初步的化合物結(jié)構(gòu)解析結(jié)果，部分化合物進(jìn)一步與標(biāo)準(zhǔn)品的色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜行為數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)照，驗(yàn)證結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果。
　　4.毛冬青根中主要成分與

7、PDEⅠ酶結(jié)合的活性研究
　　制備濃度為0.1 g·mL-1（以生藥計(jì)）的毛冬青根提取物溶液，分別與濃度為0，10 U·mL-1，20 U·mL-1的PDEⅠ酶溶液進(jìn)行孵育，后置于容量4mL截留分子量為10kDa的超濾管中進(jìn)行分離，分離后超濾內(nèi)管的藥物-蛋白復(fù)合物以50％甲醇洗脫，收集并以氮?dú)獯蹈桑ㄈ莸?00μL進(jìn)行分析。同時(shí)，精密稱取各對(duì)照品，分別加入甲醇配制成含如下濃度的對(duì)照品溶液，異綠原酸B10.24μ g·mL-1，異綠

8、原酸A8.96μg·mL-1，異綠原酸C7.84μg·mL-1，毛冬青皂苷B168.8μg·mL-1，毛冬青皂苷B253.6μg·mL-1，毛冬青皂苷A167.2μ g·mL-1，冬青素A475.2μ g·mL-1，按比例稀釋，繪制各化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算得到各化合物在供試品中的濃度。按照色譜峰增強(qiáng)因子的計(jì)算公式，計(jì)算各有效成分在不同濃度PDEⅠ酶溶液中的富集程度，研究相應(yīng)的結(jié)合活性。
　　5.毛冬青根中活性成分對(duì)PDEⅠ酶的半

9、數(shù)抑制濃度(IC50)的測(cè)定
　　毛冬青根中的主要活性成分在不同濃度下與PDEⅠ酶混合孵育，用環(huán)核苷磷酸二酯酶活性試劑盒對(duì)PDEⅠ酶的活性進(jìn)行檢測(cè)，使用多功能酶標(biāo)儀于620 nm處測(cè)定OD值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出對(duì)應(yīng)的5'-AMP釋出量，與空白對(duì)照組相比，求得相應(yīng)濃度下的酶活性抑制率。以抑制率平均值對(duì)1g[藥物濃度]作圖，用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行非線性擬合，求得相應(yīng)藥物的IC50。
　　6.毛冬青根中活性成分

10、對(duì)PDE5A、PDE9A酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)的測(cè)定
　　毛冬青根中的主要活性成分在不同濃度下分別與PDE5A、PDE9A酶混合孵育，用環(huán)核苷磷酸二酯酶活性試劑盒對(duì)PDE5A、PDE9A酶的活性進(jìn)行檢測(cè)，使用多功能酶標(biāo)儀于620 nm處測(cè)定OD值，然后根據(jù)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出對(duì)應(yīng)的5'-GMP釋出量，與空白對(duì)照組相比，求得相應(yīng)濃度下的酶活性抑制率。以抑制率平均值對(duì)1g[藥物濃度]作圖，用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行非

11、線性擬合，求得相應(yīng)藥物的IC50。
　　結(jié)果:
　　1.毛冬青根中主要成分的LC-MS分離與鑒定
　　在對(duì)毛冬青根提取的條件進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，建立了分析毛冬青根中主要成分的HPLC色譜條件;在文獻(xiàn)總結(jié)、質(zhì)譜條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，建立了液質(zhì)聯(lián)用分析毛冬青根中主要成分的質(zhì)譜條件。通過(guò)對(duì)毛冬青根的甲醇提取物進(jìn)行的分析，分離鑒定出11個(gè)化合物，分別為綠原酸、tortosideA、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、3，4，5-三咖

12、啡?？鼘幩?、毛冬青皂苷B3、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1、冬青素A。
　　2.毛冬青藥材中4種綠原酸類及4種皂苷的含量測(cè)定
　　建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定毛冬青根中8個(gè)成分含量。綠原酸，異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C，毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1，冬青素A的質(zhì)量濃度分別在1.25～12.5、2.96～29.6、3～30、3.45～34.5、13.05～130.5、32.4～324、16.

13、95～169.5、72.8～728μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率（n=9）均高于95％，RSD值均小于3.0％。3批樣品測(cè)定結(jié)果分別為:0.13～0.15、0.23～0.27、0.31～0.37、0.27～0.28、1.24～1.65、2.42～2.86、2.18～2.81、8.29～10.44mg·g-1。方法學(xué)驗(yàn)證及3批樣品的測(cè)定結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，適用于同時(shí)測(cè)定毛冬青根中8個(gè)成分的含量測(cè)定。<

14、br>　　3.毛冬青根中與PDEⅠ酶結(jié)合成分的LC-MS分析
　　應(yīng)用超濾技術(shù)，對(duì)毛冬青根提取物中具有與PDEⅠ酶結(jié)合活性的主要成分進(jìn)行富集、分離，并應(yīng)用HPLC-DAD-IT-TOF-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)相關(guān)成分進(jìn)行分析，將所得的化合物的色譜行為和質(zhì)譜數(shù)據(jù)與毛冬青根提取物中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，鑒定出11個(gè)具有PDEⅠ酶結(jié)合活性的化合物成分，分別為綠原酸、tortoside A、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、3，4，5-三咖啡?？?/p>

15、寧酸、毛冬青皂苷B3、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1、冬青素A。
　　4.毛冬青根中主要成分與PDEⅠ酶結(jié)合的活性研究
　　應(yīng)用色譜峰增強(qiáng)因子，對(duì)其中7個(gè)主要活性成分與PDEⅠ酶結(jié)合活性進(jìn)行分析，初步篩選出可能具有PDEⅠ酶抑制活性的化合物，按照結(jié)合活性大小，依次為異綠原酸A＞毛冬青皂苷B2＞異綠原酸C＞冬青素A＞異綠原酸B＞毛冬青皂苷B1＞毛冬青皂苷A1。
　　5.毛冬青根中活性成分對(duì)PDEⅠ酶的半數(shù)

16、抑制濃度(IC50)的測(cè)定
　　異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、西地那非、毛冬青皂苷B1、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1及冬青素A對(duì)PDEⅠ酶抑制活性(IC50)分別為779.5μM，1516μM,＞106μM,44.79μM,459.5μM,313.1μ M,158μM,250μM。
　　6.毛冬青根中活性成分對(duì)PDE5A、PDE9A酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)的測(cè)定
　　異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、西地

17、那非、毛冬青皂苷B1、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1及冬青素A對(duì)PDE5A酶抑制活性(IC50)分別為193.5μ M，436.8μM,＞104μM,0.43μM,1801.7μM,48.8μM,22.4μM,176.6μM;對(duì)PDE9A酶抑制活性(IC50)分別為＞104μM，213.7μM，1452μM，2568μM，3944μM，8810μM,＞105μM,4546μM。
　　結(jié)論:
　　首次建立了一種聯(lián)合應(yīng)用超濾技術(shù)