大鼠急性肺損傷中的磷酸二酯酶4活性變化及選擇性磷酸二酯酶4抑制劑的影響.pdf

1、研究背景 磷酸二酯酶(Phosphodiesterase，PDE)是一類催化水解環(huán)磷酸腺苷(adenosine3'，5'cyclicmonophosphatecAMP)，使其轉(zhuǎn)變?yōu)槭セ钚缘膯魏塑账岬年P(guān)鍵酶，是cAMP水解的唯一途徑。PDE的活性是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的重要因素。它是由人類基因編碼的一個(gè)高度保守超家族，由于PDE4選擇性抑制劑在一些重大疾病中具有潛在的治療作用，在過(guò)去的20年里，PDE4超家族的研究引起了

2、高度關(guān)注。急性肺損傷(acutelunginjury，ALI)是全身炎癥導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征的肺部表現(xiàn)，其嚴(yán)重階段即為急性呼吸窘迫綜合征(acuterespiratorydistresssyndrome，ARDS)，是一種臨床常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，目前尚缺乏有效的藥物治療，因此研發(fā)新的有效治療藥物對(duì)廣大醫(yī)務(wù)工作者是一項(xiàng)挑戰(zhàn)和機(jī)遇。 PDE4選擇性抑制劑的研發(fā)是一個(gè)熱點(diǎn)。PDE4選擇性抑制劑具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和支氣管平滑肌擴(kuò)張等

3、方面的作用，已在臨床試用于治療哮喘和COPD，結(jié)果令人鼓舞。至于PDE4選擇性抑制劑是否可用于治療和ARDS國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道不多，尚有許多基礎(chǔ)問(wèn)題有待于研究。 目的 1.探明大鼠ALI模型肺組織中PDE4的活性是否變化? 2.這種變化的相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制如何? 方法 1、本文采用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)氣道內(nèi)滴入誘導(dǎo)的大鼠ALI模型，設(shè)對(duì)照組、模型組、吡拉米司特組(1、3、10

4、mg·kg-1)和地塞米松組(dexameathone，DXM)(1mg·kg-1)； 2、高效液相(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)法測(cè)定肺組織PDE4活性； 3、ELISA法檢測(cè)肺組織中腫瘤壞死因子(tumournecrosisfactor-α，TNF-α)、白介素-10(interleukin10，IL-10)含量； 4、常規(guī)細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)中性粒細(xì)胞在支氣管

5、肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid，BALF)和肺組織中的浸潤(rùn)變化； 5、比色法測(cè)定BALF中超氧陰離子自由基(O2.-)和中性粒細(xì)胞髓過(guò)氧化酶(myeloperoxidase，MPO)； 6、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用(-x)±s表示，兩組數(shù)據(jù)間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。 結(jié)果 1.LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI模型中肺組織中PDE4活性變化的時(shí)程 用HPLC

6、測(cè)定肺組織勻漿PDE4活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)受到LPS刺激后，大鼠肺組織中PDE4活性于1h后開(kāi)始上升，到6h達(dá)峰值，而后隨時(shí)間增加而降低，24h開(kāi)始回落，48h時(shí)降低到基本接近正常大鼠肺組織中的活性表達(dá)水平。 2.LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI模型中肺組織中炎癥細(xì)胞聚集的時(shí)程 滴入LPS(2h)后，BALF中細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)與中性粒細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比增加，有顯著性差異，并隨時(shí)間增加而增加，6h達(dá)峰值，而后隨時(shí)間增加而降低，48h時(shí)基本接

7、近正常BALF中的表達(dá)水平。 3.LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI模型中肺組織中TNF-α含量的時(shí)程 當(dāng)受到LPS刺激后，大鼠肺組織中TNF-α含量從1h開(kāi)始增加，2h達(dá)峰值，與對(duì)照組相比有顯著性差異，而后隨時(shí)間增加而降低，48h時(shí)基本接近正常大鼠肺組織中的TNF-α含量。 4.LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI模型中肺組織中PDE4活性與TNF-α含量、BLAF中細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)、分葉核細(xì)胞計(jì)數(shù)三者在程度上的相關(guān)性分析 PDE4

8、酶活性的變化與肺損傷的病理程度和炎癥細(xì)胞中中性粒細(xì)胞的數(shù)目呈時(shí)效關(guān)系。兩者在程度上具有相關(guān)性。r值為0.83，P＜0.05。TNF-α的峰值出現(xiàn)時(shí)間較早，其變化趨勢(shì)與LPS誘導(dǎo)的ALI的病理變化和炎癥細(xì)胞的變化基本一致，與PDE4酶活性的變化也基本一致。 5.吡拉米司特對(duì)ALI模型中炎癥的改善作用 LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI模型BALF中白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)均顯著增加，肺水含量、BALF中MPO及超氧陰離子自由基(O2.

9、-)含量均有明顯升高(P＜0.01)，吡拉米司特預(yù)處理可抑制損傷模型中的炎癥和氧化作用(P＜0.01)。 6.吡拉米司特對(duì)大鼠ALI肺組織中TNF-α、IL-10的影響 LPS氣道內(nèi)滴入6h后，大鼠肺組織中TNF-α含量明顯升高，IL-10含量顯著降低，吡拉米司特預(yù)處理后，TNF-α含量明顯降低，在1mg·kg-1已有顯著性差異；吡拉米司特1、3、10mg·kg-1均能明顯升高IL-10的含量，但沒(méi)有明顯的量效關(guān)系，DX

10、M(1mg·kg-1)預(yù)處理抑制TNF-α和升高IL-10的作用最強(qiáng)。 7.肺組織中PDE4活性變化及與TNF-α/IL-10的關(guān)系 大鼠ALI模型肺組織中PDE4活性明顯上升(P＜0.01)，吡拉米司特預(yù)處理可抑制PDE4活性的上升，而且其對(duì)PDE4活性抑制性變化與TNF-α/IL-10比值的變化基本一致。DXM1mg·kg-1也能降低TNF-α和升高IL-10水平，調(diào)節(jié)TNF-α/IL-10平衡關(guān)系，但DXM不能抑制

11、PDE4活性的升高。 8.病理改變 與對(duì)照組相比，給予LPS6h后，肺組織呈暗紅色，表面有大量的出血、水腫區(qū)域，鏡下可見(jiàn)肺微血管充血、出血，肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)有蛋白水腫液和大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。吡拉米司特3、10mg·kg-1治療后肺微血管出血狀況明顯改善，肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)蛋白水腫液減少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯改善，中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少。 結(jié)論 本研究首次發(fā)現(xiàn)LPS氣道內(nèi)滴入可引起大鼠肺組織中PDE4活性增高

12、，LPS滴入氣道1h后PDE4活性開(kāi)始上升，6h達(dá)峰值，而后隨時(shí)間增加而降低，24h開(kāi)始回落接近正常大鼠肺組織中的活性表達(dá)水平。 肺組織勻漿cAMP-PDE活性與BALF中的中性粒細(xì)胞數(shù)目、肺組織勻漿TNF-α含量以及TNF-α/IL-10比值存在明顯的相關(guān)性。 PDE4抑制劑吡拉米司特1、3、10mg·kg-1均能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的ALI肺部炎癥性浸潤(rùn)、肺水腫和肺組織損傷。分析其作用機(jī)制，吡拉米司特呈劑量依賴抑制肺組