環(huán)核苷酸磷酸二酯酶PDE9A底物特異性和抑制劑選擇性研究.pdf

1、第一部分
　　 深入解構(gòu)保守的谷氨酰胺殘基對PDE9A抑制劑選擇性和底物特異性的影響
　　 --蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)、定向突變及分子動力學(xué)模擬研究
　　 環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(phosphodiesterases,PDEs)能特異性地以3’,5’-環(huán)核苷酸為底物,可以通過催化水解cAMP和/或cGMP生成相應(yīng)的無活性的AMP和/或GMP而控制其在細胞內(nèi)的濃度,從而影響多種生理過程和代謝功能。所有PDE蛋白活性部位都有一個

2、絕對保守的谷氨酰胺殘基。這個殘基在PDE的催化活性中發(fā)揮關(guān)鍵作用,但其是否在識別僅存在細微差別的cAMP和cGMP方面起決定性的作用仍有爭議。
　　 我們在PDE9A中保守的谷氨酰胺殘基(Gln453)突變?yōu)楣劝彼?對該谷氨酰胺殘基側(cè)鏈構(gòu)象起穩(wěn)定作用的谷氨酸殘基(Glu406)突變?yōu)楸彼?并對突變蛋白進行了晶體學(xué)研究、酶動力學(xué)測定和分子動力學(xué)模擬。突變蛋白的酶促反應(yīng)動力學(xué)測定結(jié)果表明,Q453E突變導(dǎo)致PDE9A蛋白對cGMP

3、的親和力下降了約25倍,而對cAMP的親和力基本保持在同一水平。PDE9A(Q453E)/S-Bay73-6691復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)及PDE9A(Q453E)/IBMX復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)顯示,Q453E突變沒有導(dǎo)致Glu453殘基側(cè)鏈構(gòu)象的顯著變化,但導(dǎo)致底物結(jié)合部位局部微環(huán)境的變化。分子動力學(xué)模擬結(jié)果證實了此由Q453E突變導(dǎo)致的局部微環(huán)境的變化。此外,酶動力學(xué)測定結(jié)果表明,Q453E突變在不同程度上影響不同抑制劑的結(jié)合,其對PDE9A選擇性

4、抑制劑及Bay73-6691抑制活性的影響遠遠大于對非選擇性抑制劑IBMX和PDE5/6抑制劑Zaprinast的影響。酶促反應(yīng)動力學(xué)結(jié)果也表明,E406A突變僅導(dǎo)致PDE9A蛋白對底物和抑制劑的親和力發(fā)生輕微變化。
　　 本研究結(jié)果表明,保守的谷氨酰胺殘基對底物/抑制劑的結(jié)合發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用,但該殘基并不能決定PDE9A蛋白的底物特異性和抑制劑選擇性。本研究的結(jié)果將有助于新的高選擇性PDE9A抑制劑的設(shè)計。
　　 第

5、二部分
　　 PDE9A與一種新型抑制劑復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)和酶動力學(xué)研究
　　 選擇性PDE9A抑制劑可用于治療糖尿病、阿爾茨海默氏癥等疾病。目前已有的PDE9A抑制劑普遍存在選擇性不夠高、副作用較強的問題。本研究組根據(jù)PDE9A與抑制劑Bay73-6691復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)及定向突變蛋白的酶促反應(yīng)動力學(xué)信息,設(shè)計并合成了一系列新的選擇性PDE9A抑制劑,其中最好的一個抑制劑LW-AO的抑制活性(42 nM)明顯高于Bay73