特異性抑制5型磷酸二酯酶通過(guò)緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激治療心力衰竭的作用及其機(jī)制.pdf

1、研究背景與目的：
　　磷酸二酯酶基因家族（PDE family）在體內(nèi)廣泛分布，有11種亞型。PDE家族的主要功能是水解細(xì)胞內(nèi)的第二信使3'，5'-環(huán)狀腺苷酸（cAMP）和（或）3'，5'-環(huán)狀鳥(niǎo)苷酸（cGMP），繼而影響其下游蛋白激酶活性，從而調(diào)控各種生物學(xué)效應(yīng)。目前，作用于PDE的藥物如磷酸二酯酶抑制藥已在臨床上廣泛應(yīng)用，如治療心血管疾病、肺動(dòng)脈高壓、勃起功能障礙和哮喘等。
　　在全球范圍內(nèi)，心力衰竭（Heart Fai

2、lure，HF）是威脅人類健康和增加醫(yī)療負(fù)擔(dān)最主要的疾病之一。有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ER stress）在心力衰竭病人的心肌中被激活，并被證明是心力衰竭發(fā)生和發(fā)展的重要機(jī)制。不僅如此，有研究發(fā)現(xiàn)特異性水解cGMP的5型磷酸二酯酶（PDE5）在心力衰竭的病人心肌中表達(dá)明顯升高。5型磷酸二酯酶的抑制劑具有明顯的抗心肌肥厚和心力衰竭的作用。而在心肌肥厚及心力衰竭中，5型磷酸二酯酶與內(nèi)

3、質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系目前尚無(wú)報(bào)道。本研究通過(guò)使用人的心力衰竭的組織標(biāo)本、心力衰竭的動(dòng)物模型以及相關(guān)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究5型磷酸二酯酶與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果：
　　首先，在人的心力衰竭的組織標(biāo)本中尋找5型磷酸二酯酶與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)用到了4例因擴(kuò)張型心肌病行心臟移植術(shù)的心臟標(biāo)本、6例因心力衰竭行二尖瓣置換術(shù)的心臟標(biāo)本，以及4例因交通事故死亡的正常心臟標(biāo)本。應(yīng)用Western blotting的方法檢測(cè)這些組織標(biāo)本

4、中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活狀態(tài)和PDE5的表達(dá)。結(jié)果顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的效應(yīng)分子，包括P-PERK、GRP78、XBP1s和CHOP，在心力衰竭的組織樣品中表達(dá)都顯著升高。有趣的是，還發(fā)現(xiàn)PDE5在衰竭的心臟組織中的表達(dá)也明顯升高，并且PDE5高表達(dá)的程度與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物表達(dá)增加的程度明顯相關(guān)。由此說(shuō)明，在心力衰竭中PDE5的表達(dá)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能存在相關(guān)關(guān)系。
　　隨后，用異丙腎上腺素（isoproterenol，Iso）和胸主動(dòng)脈縮窄術(shù)

5、（transverse aortic constriction，TAC）建立了兩種心力衰竭的動(dòng)物模型。通過(guò)形態(tài)學(xué)、血流動(dòng)力學(xué)和心臟超聲檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PDE5抑制劑能夠明顯緩解Iso和TAC誘發(fā)的心肌肥厚和心力衰竭。為進(jìn)一步研究抑制PDE5是否能夠緩解心力衰竭中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了動(dòng)物模型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDE5抑制劑（西地那非）明顯地緩解心力衰竭中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記物的高表達(dá)。嚴(yán)重或長(zhǎng)期的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激觸發(fā)細(xì)胞凋亡，這被認(rèn)為是

6、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致心力衰竭的關(guān)鍵機(jī)制。為此，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異的凋亡蛋白C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）的表達(dá)和心力衰竭中凋亡細(xì)胞的數(shù)量。研究結(jié)果表明，在心力衰竭動(dòng)物模型中，PDE5抑制劑能夠明顯抑制CHOP的表達(dá)和心肌細(xì)胞的凋亡。為進(jìn)一步明確抑制PDE5對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用，用Iso、毒胡蘿卜素（thapsigargin，TG。TG是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜鈣泵抑制劑。它可以促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)鈣清空導(dǎo)

7、致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，是特異性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激刺激劑。）和西地那非干預(yù)H9c2（2-1）心肌細(xì)胞。結(jié)果顯示，在體外實(shí)驗(yàn)中抑制PDE5同樣可以緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及其介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。
　　此外，還研究了蛋白激酶G（PKG）在PDE5抑制劑抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用。結(jié)果顯示，PKG的抑制劑KT5823和DT3部分扭轉(zhuǎn)了PDE5抑制劑西地那非在心肌細(xì)胞中的抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用。這提示PKG途徑部分參與了PDE5抑制劑對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的保護(hù)作用。肌漿網(wǎng)鈣調(diào)節(jié)蛋白

8、和細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)。因此，我們?cè)谛牧λソ邉?dòng)物模型中檢測(cè)了肌漿網(wǎng)鈣調(diào)節(jié)蛋白肌漿網(wǎng)（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）鈣泵2a（sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase2a，SERCA2a）和受磷蛋白（phospholamban，PLB）的表達(dá)。結(jié)果顯示，抑制PDE5扭轉(zhuǎn)了心力衰竭動(dòng)物模型心肌中SERCA2a和磷酸化的PLB（P-PLB）的表達(dá)下調(diào)。這提示，PDE5抑制劑可能是通過(guò)對(duì)SERCA2a和P-PLB表達(dá)

9、的調(diào)控從而發(fā)揮其抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用。為進(jìn)一步明確其具體作用機(jī)制，本研究運(yùn)用PLB的野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒（16位絲氨酸→丙氨酸）確定PLB16位絲氨酸在PDE5抑制劑抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)中起關(guān)鍵作用。
　　結(jié)論：
　　綜上所述，在心力衰竭的動(dòng)物模型中特異性抑制PDE5可以明顯改善心臟功能，并且能夠明顯緩解心力衰竭中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。抑制PDE5治療心力衰竭的機(jī)制可能是通過(guò)其抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用實(shí)現(xiàn)的。這為PDE5抑制劑用于心力衰竭的治