選擇性磷酸二酯酶IV（PDE4）抑制劑Zl-n-91對人記性Th17細胞抑制作用的研究.pdf

1、Th17細胞，是一種新發(fā)現(xiàn)的能夠產生白介素-17(IL-17)的T輔助細胞亞型。Th17細胞具有高度的促炎癥性，并能夠誘導嚴重的自身免疫。大量證據(jù)表明IL-17與多種自身免疫性疾病的病理相關，包括類風濕性關節(jié)炎、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和克隆氏疾病。在動物模型關節(jié)炎中，用抗體或可溶性的受體阻斷IL-17，能夠緩解炎性癥狀。 磷酸二酯酶是由催化環(huán)磷腺苷(cAMP)和環(huán)磷鳥苷(cGMP)水解成相應的一磷酸鹽的酶蛋白超家族組成，在多種生

2、理功能中起重要作用。磷酸二酯酶抑制劑在多種炎癥性疾病包括哮喘、慢性阻塞性肺疾病、變應性鼻炎和異位性皮炎中有效。選擇性磷酸二酯酶Ⅳ抑制劑(PDE4)通過抑制cAMP的水解而升高細胞內的cAMP水平，在臨床上已經被證明是呼吸道炎癥性疾病的一種抗炎藥。在動物模型中，關節(jié)炎和膿毒癥也是磷酸二酯酶抑制劑的適應癥。 在目前的研究中，我們觀察了選擇性磷酸二酯酶Ⅳ抑制劑Zl-n-91對Th17細胞的作用。正常志愿者外周血單個核細胞(PBMCs)

3、用抗CD3(anti-CD3)和抗CD28(anti-CD28)單克隆抗體刺激，加或不加Zl-n-91。IL-17水平用ELISA和RT-PCR的方法檢測。我們的實驗結果表明加入Zl-n-91能夠抑制anti-CD3／anti-CD28誘導的IL-17的產生，且這一抑制作用呈劑量依賴效應。相應的半數(shù)抑制量(即抑制最大量的一半)在這個范圍內：50-100μM。Zl-n-91同時抑制IL-17mRNA表達水平。純化的CD4+T細胞用anti

4、-CD3／anti-CD28刺激，加或不加Z1-n-91，結果顯示，Z1-n-91在轉錄和翻譯水平上抑制IL-17的產生和表達。流式結果表明Zl-n-91通過抑制CD4+T細胞活化、增殖和分裂來抑制記憶性Thl7細胞產生IL-17。我們的結果表明Zl-n-91可能在IL-17相關的自身免疫性疾病的治療中具有重大的應用前景。 目的 探討選擇性磷酸二酯酶Ⅳ抑制劑Zl-n-91對記憶性Th17細胞產生IL-17的作用及其作用機

5、制。 方法 (1)肝素抗凝血用密度梯度離心法分離，獲得正常人PBMCs，加anti-CD3／anti-CD28共培養(yǎng)細胞，再加入不同濃度的Zl-n-91，用ELISA方法檢測培養(yǎng)上清中IL-17和IFN-γ產生的量，觀察Zl-n-91對PBMCs產牛IL-17和IFN-γ的影響。 (2)用磁珠分選法分離正常人PBMCs中的CD4+T細胞，用anti-CD3預先包被96孔板，再加入anti-CD28和不同濃度的Zl

6、-n-91，孵育3天后用ELISA方法檢測培養(yǎng)上清中IL-17和IFN-γ產生的量，觀察Zl-n-91對CD4+T細胞產生IL-17和IFN-γ的作用。 (3)用六孔板培養(yǎng)PBMCs，并加入anti-CD3／anti-CD28刺激細胞，或者用anti-CD3預先包被6孔板，再加入anti-CD28共培養(yǎng)磁珠分選出來的純化CD4+T細胞，加或不加Zl-n-91。孵育20h后收集細胞，用TRIzol裂解細胞，按照美國Invitrog

7、en公司RNA提取的試劑盒提取總的RNA，再按照逆轉錄試劑盒的操作流程將總的RNA逆轉錄為cDNA，最后利用PCR技術將cDNA中的目的基因擴增。通過瓊脂糖凝膠電泳可以將擴增的目的基因以條帶的方式半定量顯示。 (4)PBMCs加入anti-CD3／anti-CD28共培養(yǎng)，加或不加Zl-n-91。使用流式細胞術在單個細胞水平上評價Zl-n-91對細胞內細胞因子IL-17、IFN-γ和IL-2及T淋巴細胞表面活化分子CD25、CD

8、69表達的影響。 (5)PBMCs用上述方法培養(yǎng)，3天后收集細胞，按BD PharmingenTM BrdU流式試劑盒說明書的操作流程給不同培養(yǎng)條件的細胞摻入BrdU，再使用流式細胞技術分析Zl-n-91對BrdU摻入的影響。 (6)按CFSE試劑盒說明書的操作流程標記PBMCs，然后按上述方法刺激培養(yǎng)細胞，3天后收集細胞，進行表面染色，再使用流式細胞技術分析Zl-n-91對細胞分裂的影響。 結果 (1)

9、Zl-n-91能夠抑制anti-CD3／anti-CD28誘導的正常人PBMCs IL-17的產生，且這一效應呈劑量依賴性。它不是IL-17特異性的抑制劑，除了抑制IL-17，它還抑制IFN-γ的產生。 (2)對PBMCs，RT-PCR結果顯示，Zl-n-91同時能在轉錄水平上抑制IL-17的基因轉錄。即Zl-n-91對IL-17抑制作用在轉錄和翻譯水平是一致的。 (3)T細胞亞群分析的結果表明，IL-17主要由CD4+

10、T淋巴細胞表達，而Zl-n-91能夠抑制CD4+T淋巴細胞IL-17、IFN-γ和IL-2的表達。重要的是，Zl-n-91能夠抑制記憶性Th17細胞亞群IL-17的表達，而對IFN-γ,則同時抑制初始和記憶性T細胞IFN-γ的表達。更重要的是，Zl-n-91在加入的每個時間點都有抑制作用，并且在細胞被活化1h后加入仍然有抑制作用。 (4)Zl-n-91能夠直接作用于CD4+T細胞，在翻譯水平上，它能抑制anti-CD3／anti

11、-CD28誘導的正常人純化的CD4+T淋巴細胞IL-17和IFN-γ的產生，并且呈劑量依賴性。在轉錄水平上，其作用與翻譯水平上相一致，它能夠抑制IL-17的基因轉錄，降低IL-17mRNA的表達水平。 (5)Zl-n-91能夠抑制anti-CD3／anti-CD28誘導的CD4+T細胞表面CD25和CD69的表達，并且Zl-n-91能夠抑制CD4+T淋巴細胞BrdU的摻入并且降低由CFSE標記的CD4+T細胞的分裂次數(shù)，即Zl-

12、n-91能夠抑制anti-CD3／anti-CD28誘導的CD4+T細胞的活化、增殖和分裂。 結論 本研究證明了Zl-n-91能夠以劑量依賴方式抑制正常人PBMCs中IL-17和IFN-γ的產生。同時在基因轉錄水平上抑制IL-17mRNA的表達。流式結果分析顯示Zl-n-91抑制CD4+T淋巴細胞IL-17、IFN-γ和IL-2的表達。Zl-n-91在加入的每個時間點都能抑制記憶性Th17細胞IL-17的表達，同時抑制初