新型PDE4抑制劑ZL-n-91對小鼠內毒素性肺損傷的改善作用.pdf

1、研究背景： 急性肺損傷(acute lung injury,ALI)，嚴重時稱之為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，是因急性肺水腫和炎癥導致的特殊類型呼吸衰竭綜合征，與多種致病因素如肺炎、敗血癥、急性胰腺炎、藥物過量服用等有關。臨床表現(xiàn)為頑固性低氧血癥、呼吸頻數(shù)和呼吸窘迫，胸部x線顯示雙肺彌漫性浸潤影，后期多并發(fā)多器官功能障礙[1]。ALI/MARDS的死亡率

2、很高，到目前為止，仍然沒有治療AU并BARDS的特效藥物，因此探索治療新靶點，尋找和開發(fā)ARDS治療新藥是研究者的目標。 近來環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)通過對炎癥細胞及免疫細胞的調節(jié)參與ALI/MARDS的發(fā)病過程越來越受到重視。cAMP和cGMP是細胞內重要的第二信使，與特異性蛋白激酶結合后導致各種底物磷酸化，調節(jié)體內的各種病理生理過程。PDE是細胞內降解環(huán)核苷酸的唯一途徑，對調節(jié)這類第二信使的細胞內水平起

3、關鍵作用。cAMP可抑制免疫和炎癥細胞的多種功能，在這些細胞中cAMP-特異性的PDFA是主要的PDE形式，PDE4抑制劑能增加cAMP的水平，且在各種動物模型中表現(xiàn)出抗炎作用[2]。 本實驗探討經典的PDE4抑制劑咯利普蘭(Rolipram，ROL)和新型PDE4抑制劑ZL-n-91.對小鼠內毒素性肺損傷的改善作用，并進一步探索其作用機制。 目的： 研究經典PDE4抑制劑咯利普蘭和新型PDE4抑制劑ZL-n-9

4、1.對小鼠內毒素性肺損傷的改善作用及機制。 方法： 一、咯利普蘭對小鼠急性肺損傷的改善作用 脂多糖(LPS)3.0 mg·kg-1氣管內滴入誘導小鼠急性肺損傷。設正常對照組、模型組、咯利普蘭(0.1 mg,0.3 mg和1.0mg·kg-1，ip)組和地塞米松(0.5 mg·kg-1，ip)組，給藥6h后處死小鼠。常規(guī)細胞形態(tài)學方法檢測支氣管肺泡灌洗液(BAI F)中性粒細胞數(shù)目，觀察肺濕重／干重(W／D)比值和

5、肺組織病理的改變，考馬斯亮蘭法測定BALF中總蛋白含量，髓過氧化物酶(MPO)活性測定試劑盒測定肺組織勻漿中MPO活性，ELISA法測定肺組織勻漿中腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量，高效液相層析(HPIC)法測定肺組織勻漿中環(huán)腺苷酸磷酸二酯酶(cAMP-PDE)和磷酸二酯酶4(PDE4)活性。 二、新藥ZL-n-91對小鼠急性肺損傷的改善作用 脂多糖(LPS)3mg·kg-1氣管內滴入誘導小鼠急性肺損傷。設正常對照組、模

6、型組、新型PDE4抑制劑zL廣n-91(0.3μg，1.0μg，3.0μg·kg-1，ip)組、地塞米松(0.5mg·kg-1，ip)組、經典PDFA抑制劑咯利普蘭(1.0mg·kg-1，ip)組。常規(guī)細胞形態(tài)學方法檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中性粒細胞數(shù)目，觀察肺濕重／干重(W／D)比值和肺組織病理的改變，考馬斯亮蘭法測定BALF中總蛋白含量，髓過氧化物酶(MPO)活性測定試劑盒測定肺組織勻漿中MPO活性，ELISA法測定肺組織勻

7、漿中腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量，高效液相層析(HPLC)法測定肺組織勻漿中環(huán)腺苷酸磷酸二酯酶(cAMP-PDE)和磷酸二酯酶4(PDE4)活性，血氣分析測定動脈血氧分壓(medal partial pressure 0f oxygen，PaO2)、動脈血二氧化碳分壓(arterialpartial pressure of carbon dioxide，PaCO2)、動脈血PH值等指標，采用Robichaud A[3]等的方法，觀察

8、并記錄各用藥組對其麻醉作用持續(xù)時間即翻正反射恢復時間的影響，來評價ZL-n-91的致嘔反應。 結果： 一、咯利普蘭對小鼠急性肺損傷的改善作用 小鼠氣道內滴入LPS 6 h后，：BALF中的白細胞總數(shù)和中性粒細胞數(shù)目迅速上升，與對照組比較分別增加了3.2倍和10.9倍(P＜0.01)；模型組肺濕重／干重(W／D)比值明顯升高(P＜0.01)；肺組織病理切片可見肺血管、氣道周圍有大量中性粒細胞浸潤；BALF中蛋白含量

9、明顯升高，與對照組比較增加了1.5倍(P＜0.01)；肺組織勻漿MPO活性和TNF-α含量顯著增加，與對照組比較分別增加了1.7倍和2.0倍(P＜0.01)；肺組織中cAMP-PDE及PDE4的活性明顯升高，與對照組比較分別增加了3.4.倍和3.0倍(P＜0.01)。腹腔注射ROL(0.1 mg,0.3 mg和1.0 mg·kg-1)能夠劑量依賴性的降低BALF中白細胞及中性粒細胞的數(shù)目(P＜0.05)；ROL，(0.1 mg，0.3

10、mg和1.0 mg·kg-1)可降低ALI小鼠肺濕重／干重(W／D)比值，0.3 mg·k-1與模型組相比即有顯著性差異(P＜0.01)；ROL各組肺病變均較模型組減輕，氣道周圍及肺組織間隙中性粒細胞明顯減少，肺水腫明顯減輕；ROL，各組BALF中蛋白明顯減少，1.0 mg·k-1即能顯著降低BALF中蛋白含量(P＜0.01)；ROL能顯著降低MPO水平，0.3 mg·kg-1即有顯著性差異(P＜0.01)，呈劑量依賴性降低TNF-α水

11、平(P＜0.05)；ROI，可以抑制肺組織中cAMP-PDE及PDE4的活性的升高，0.3 mg·kg-1能顯著抑制cAMP-PDE的活性(P＜0.01)，1.0 mg．kg-1能顯著抑制PDE4的活性(P＜0.01)。 二、新藥ZL-n-91對小鼠急性肺損傷的改善作用 小鼠氣道內滴入LPS 6 h后，BALF中的白細胞總數(shù)和中性粒細胞數(shù)目迅速上升，與對照組比較分別增加了2.86倍和6.16倍(P＜0.01)；模型組肺濕

12、重／干重(W／D)比值明顯升高(P＜0.01)；肺組織病理切片可見肺血管、氣道周圍有大量中性粒細胞浸潤；BALF中蛋白含量明顯升高，與對照組比較增加了1.35倍(P＜0.01)；肺組織勻漿MPO活性和TNF-α含量顯著增加，與對照組比較分別增加了1.51倍和2.23倍(P＜0.01)；肺組織中cAMP-PDE及PDE4的活性明顯升高，與對照組比較分別增加了2.77倍和1.95倍(P＜0.01)；模型組小鼠外周血動脈血PH值、動脈血氧分壓

13、(arterial partial pressure of oxygen，PaO2)、動脈血二氧化碳分壓(arterial partial pressure of carbon dioxide，PaCO2)等各項指標較正常對照組有明顯變化，其中PH值和PaO2較正常組有顯著下降，但在統(tǒng)計學上無顯著性差異，PaCO2方面，模型組較正常組有顯著上升，在統(tǒng)計學上有顯著性差異CP＜0.01)；腹腔注射ZL-n-91(0.3μg，1.0μg，3.

14、0μg·kg-1)能夠劑量依賴性的降低BALF中白細胞及中性粒細胞的數(shù)目(P＜0.05)；ZL-n-91各劑量組能明顯降低肺W/D比值，但與模型組相比無顯著性差異，ROL和DXM能顯著降低肺W／D比值(P＜0.05)；ZL-n-91各組肺病變均較模型組減輕，氣道周圍及肺組織間隙中性粒細胞明顯減少，肺水腫明顯減輕；ZL-n-91各劑量組顯著降低BALF中蛋白，ZL-n-91 0.3μg·k-1即有顯著性差異(P＜0.05)；ZL-n-91

15、.0.3μg，1.0μg和3.0 μg·kg-1各劑量組呈劑量依賴性的降低肺組織中MPO活性，同時也能顯著降低TNF-α水平；ZL-n-91各劑量組與模型組相比cAMP-PDE及PDE4活性明顯降低，但ZL-n-910.3μg．kg-1與模型組相比無顯著性差異，ZL-n-91 0.3μg·kg-1，1.0μg·kg-1與模型組相比有顯著性差異(P＜0.05)；血氣方面：ZL-n-91各劑量組及ROL組、DXM組PH均有明顯下降，與模型組

16、相比無顯著性差異，但與正常組比較均存在顯著性差異(P＜0.05)，各PDE4抑制劑組PaO2有所改善，以ZLn-91高劑量和ROL為顯著，但與模型組及正常組比較，均無顯著性差異，ZL-n-91低、中劑量組對PaCO2改善作用不明顯，ZL-n-91高劑量和ROL改善作用顯著，但與模型組及正常組比較，均無顯著性差異。而DXM對PaCO2和PaO2方面作用不明顯；溶媒對照組與生理鹽水對照組比較，翻正反射的恢復時間無明顯差異，ZL-n-9各組用

17、藥后翻正反射的恢復時間明顯縮短，低劑量組與對照組比較無顯著性差異，中劑量組和高劑量組與溶媒對照組相比出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.01)。但高劑量組翻正反射的恢復時間又有延長，ROL組與高劑量組時間相當，而DXM與生理鹽水對照組也相當。 結論： 綜上結果表明，ROL和新藥ZL-n-91都能通過減少蛋白滲出及肺水含量，抑制肺組織中性粒細胞浸潤，降低肺組織MPO和TNF-α水平，抑制PDE4的活性等方面改善LPS誘導的小鼠急性肺損