骨骼肌環(huán)核苷酸磷酸二酯酶表達(dá)與活性及其中藥作用研究.pdf

1、環(huán)核苷酸(cAMP、GMP)作為第二信使，在各種組織細(xì)胞增殖、分化和終末細(xì)胞功能中扮演著重要的角色，而磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cAMP、cGMP水平的關(guān)鍵酶。為探討中藥能否通過調(diào)節(jié)骨骼肌PDE提高環(huán)核苷酸水平，促進(jìn)動物生長，本研究運(yùn)用RT-PCR、細(xì)胞培養(yǎng)、HPLC、ISA、免疫細(xì)胞化學(xué)和圖像分析等技術(shù)，進(jìn)行了骨骼肌組織和細(xì)胞10個PDE家族的18個同功酶亞型mRNA表達(dá)，中藥調(diào)節(jié)骨骼肌cAM

2、P PDE活性，中藥促骨骼肌原代培養(yǎng)細(xì)胞蛋白合成作用，以及對中藥促動物生長作用的研究。結(jié)果如下： 成功設(shè)計了18對PDE引物，通過RT-PCR方法檢測到中國實驗用小型豬骨骼肌組織除PDE1B和PDE11A外共16個同功酶亞型mRNA表達(dá)；ICR小鼠骨骼肌組織和細(xì)胞除PDE8B外共17個同功酶亞型mRNA表達(dá)；各亞型mRNA表達(dá)程度存在差異；豬和鼠骨骼肌組織和細(xì)胞中以cAMP特異性的PDE4A、PDE4B和PDE7A為主要表達(dá)。

3、 HPLC法檢測了近200種常用中藥對小鼠骨骼肌組織cAMP PDE活性的影響，秦皮等18味中藥對cAMP：PDE活性具有促進(jìn)作用：其余中藥對cAMP PDE活性有不同程度的抑制作用，其中石韋等62味中藥的抑制率超過20％；抑制率超過50％的中藥有青皮、密蒙花、玄參、生艾葉、木瓜、地骨皮、牛蒡子、附子、枳實、胡黃連10味中藥。 細(xì)胞培養(yǎng)、HPLC、ELISA和考馬斯亮藍(lán)方法檢測到中藥牛蒡子有效成分牛蒡子苷在濃度為2.5μg

4、/ml時，顯著抑制骨骼肌原代培養(yǎng)細(xì)胞cAMP PDE活性(P<0.01)，提高細(xì)胞內(nèi)cAMP含量(P<0.05)，促進(jìn)細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成(P<0.01)；RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)染色和圖像分析技術(shù)檢測結(jié)果表明，主要表達(dá)的cAMP特異性PDE包括PDE4A、PDE4B和PDE7A的mRNA表達(dá)和蛋白合成無明顯變化(P>0.05)。 HPLC和ELISA等方法檢測到中藥牛蒡子的三個濃度和其有效成分牛蒡子苷的兩個低濃度都能極顯著抑制骨

5、骼肌組織cAMP PDE活性(P<0.01或P<0.001)，顯著或極顯著提高骨骼肌組織cAMP含量(P<0.05或P<0.01或P<0.001)，三個濃度的牛蒡子都能極顯著提高血漿中cAMP水平(P<0.01或P<0.001)，而三個濃度的牛蒡子苷能夠使cAMP水平顯著提高(P<0.05)。 動物喂養(yǎng)試驗表明，牛蒡子苷能顯著提高小鼠生長速度，牛蒡子能極顯著提高小鼠生長速度。其作用主要是通過抑制PDE活性，升高cAMP水平，進(jìn)而

6、促進(jìn)蛋白合成實現(xiàn)。 上述結(jié)果表明，PDE同功酶在骨骼肌組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)，以cAMP特異性PDE為主要分布；大部分常用中藥對骨骼肌cAMP PDE活性都有抑制作用；對骨骼肌cAMP PDE活性具有較高抑制率的中藥能夠提高cAMP含量，促進(jìn)骨骼肌原代培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，并促進(jìn)動物生長。 本研究探討了骨骼肌PDE同功酶表達(dá)規(guī)律，驗證了第二信使環(huán)核苷酸在骨骼肌生長過程中的作用，證明了中藥通過抑制PDE活性，升高cAMP水平促