脊索細胞體外誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化及聯(lián)合移植阻止兔椎間盤退行性變的實驗研究.pdf

1、第一部分脊索細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)和鑒定
　　 目的:分離兔髓核脊索細胞及骨髓間充質(zhì)干細胞，通過形態(tài)學及流式細胞術對兩種細胞進行鑒定，為下一步細胞試驗奠定基礎。
　　 方法:4-6周齡新西蘭兔4只，取胸腰段脊柱的髓核，用密度梯度離心法提取脊索細胞，同時取其股骨骨髓用FICOLL液分離得到骨髓間充質(zhì)干細胞，光鏡觀察脊索細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞的生長情況，取原代脊索細胞脊進行電鏡觀察；對第3代的骨髓間充質(zhì)干細胞進行表

2、面抗原CD34、CD44、CD29、CD45的檢測。
　　 結果:光鏡下觀察原代脊索細胞呈圓形或橢圓形，胞體大，細胞增殖不明顯。骨髓間充質(zhì)干細胞呈梭形貼壁生長，旋渦狀排列，細胞貼壁后折光性較差。電鏡掃描發(fā)現(xiàn)脊索細胞大小約為20-30um，細胞形態(tài)呈圓形或者橢圓形，細胞膜表面可見大量糖原分布，細胞內(nèi)可見大量的大小不一的囊泡存在。對第3代的骨髓間充質(zhì)干細胞進行表面抗原的檢測發(fā)現(xiàn)：細胞表達CD34、CD44陰性，CD29、CD45陽性

3、。其中CD34的平均表達率為3.9％，CD44的平均表達率為4.4％，CD45的平均表達率為96.2％，CD29的平均表達率為88.1％。
　　 結論:使用密度梯度離心法可以分離出脊索細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞，經(jīng)過細胞鑒定兩種細胞均表現(xiàn)出特征性特點，為進一步試驗奠定了基礎。
　　 第二部分接觸性共培養(yǎng)脊索細胞促進骨髓間充質(zhì)干細胞增值及定向誘導分化的實驗研究
　　 目的:分離兔髓核脊索細胞及骨髓間充質(zhì)干細胞，通過共培

4、養(yǎng)探討脊索細胞對骨髓間充質(zhì)干細胞增值能力及細胞表型的影響。
　　 方法:4-6周齡新西蘭兔4只，取胸腰段脊柱的髓核，用密度梯度離心法提取脊索細胞，同時取其股骨骨髓用FICOLL液分離得到骨髓間充質(zhì)干細胞，光鏡觀察脊索細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞不同比例（1:2、1:1、2:1）共培養(yǎng)條件下細胞的生長情況、CCK-8法檢測細胞增殖。脊索細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)（1:1）后行甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原染色檢測骨髓間充質(zhì)干細胞的細胞表型的改

5、變情況。對共培養(yǎng)后的骨髓間充質(zhì)干細胞進行相關基因表達的檢測。
　　 結果:光鏡下觀察原代脊索細胞呈圓形或橢圓形，胞體大，細胞增殖不明顯。骨髓間充質(zhì)干細胞呈梭形貼壁生長，旋渦狀排列，細胞貼壁后折光性較差。CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)脊索細胞/骨髓間充質(zhì)干細胞 1:1組細胞增殖明顯高于其余各組。甲苯胺藍染色骨髓間充質(zhì)干細胞單獨培養(yǎng)組呈陰性，共培養(yǎng)組呈陽性。Ⅱ型膠原染色骨髓間充質(zhì)干細胞單獨培養(yǎng)組呈陰性，共培養(yǎng)組呈陽性。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)

6、組蛋白聚糖及Ⅱ型膠原的表達分別為脊索細胞的2倍、1.35倍，而單獨培養(yǎng)的MSC則表達陰性。
　　 結論:在共培養(yǎng)條件下脊索細胞可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞增值，且細胞比例為1:1時更為顯著；同時可以誘導其產(chǎn)生Ⅱ型膠原及聚集蛋白聚糖，表現(xiàn)出類軟骨細胞表型。
　　 第三部分非接觸共培養(yǎng)脊索細胞誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向類軟骨細胞分化的實驗研究
　　 目的:分離兔髓核脊索細胞（NC）及骨髓間充質(zhì)干細胞（MSC），通過非接觸共培

7、養(yǎng)探討脊索細胞對MSC細胞表型的影響。
　　 方法:取4-6周齡新西蘭兔8只，取胸腰段脊柱的髓核，用密度梯度離心提取脊索細胞，同時取其股骨骨髓用FICOLL液分離，光鏡觀察脊索細胞和MSC等比例（1:1）非接觸共培養(yǎng)條件下的生長情況。對非接觸共培養(yǎng)（1:1）和單獨培養(yǎng)的MSC行免疫組化及RT-PCR、Western-blot檢測MSC的細胞表型的改變情況。
　　 結果:原代脊索細胞呈圓形或橢圓形，細胞體積大，細胞增殖不明

8、顯。MSC呈梭形貼壁生長，呈三角形或梭形，旋渦狀排列，兩端呈尖性突起，細胞折光性較差。非接觸共培養(yǎng)后，行甲苯胺藍染色MSC單獨培養(yǎng)組呈陰性，與NC非接觸共培養(yǎng)的MSC組呈陽性。Ⅱ型膠原免疫組化MSC單獨培養(yǎng)組呈陰性，與NC非接觸共培養(yǎng)的MSC組呈陽性呈陽性。通過RT-PCR、Western-blot在基因及蛋白水平檢測后發(fā)現(xiàn)：非接觸共培養(yǎng)的MSC組其Ⅱ型膠原及蛋白聚糖的表達明顯增多，與對照組有顯著性差異。
　　 結論:在非接觸共

9、培養(yǎng)條件下脊索細胞可以誘導MSC向類軟骨細胞方向分化，為組織工程化髓核的種子細胞篩選提供新選擇。
　　 第四部分聯(lián)合移植脊索細胞和MSC阻止兔椎間盤退行性變的實驗研究
　　 目的:使用纖維環(huán)穿刺抽吸法造模兔椎間盤退行性變，聯(lián)合移植脊索細胞（NC）及骨髓間充質(zhì)干細胞（MSC）到退變的椎間盤內(nèi)，觀察退變椎間盤的變化。
　　 方法:取1-1.5kg新西蘭兔12只，手術對兔脊柱L3-4、L4-5、L5-6、L6-7四個椎

10、間盤行穿刺抽吸髓核組織造模，造模2周后取等比例共培養(yǎng)3天脊索細胞和MSC移植到L4-5；單獨的脊索細胞移植到L5-6；單獨的MSC移植到L6-7。動物飼養(yǎng)2周后處死行髓核組織的免疫組化及Western-blot檢測椎間盤退變的改變情況。
　　 結果:穿刺抽吸髓核組織后2周行MRI檢測兔椎間盤退行性變模型％ST2WI值較2周前相比明顯下降，經(jīng)過細胞移植后各組％ST2WI值均較對照組增高，尤其以聯(lián)合細胞組為著。HE染色及甲苯胺藍染色

11、顯示聯(lián)合細胞移植后，椎間盤髓核內(nèi)軟骨樣細胞明顯增多，細胞外基質(zhì)較各組豐富。Ⅱ型膠原免疫組化：聯(lián)合細胞移植組在髓核內(nèi)較其它3組可見大片棕色區(qū)域，其間存在深染的棕黃色顆粒，基質(zhì)內(nèi)可見黃染陽性的軟骨樣細胞，靠近細胞處染色較深。通過Western-blot在蛋白水平檢測后發(fā)現(xiàn)：對照組Ⅰ型膠原呈現(xiàn)高表達，分別是聯(lián)合細胞移植組、單獨移植脊索細胞組、單獨移植MSC組的24.78倍、13.63倍和14.03倍。聯(lián)合細胞移植組Ⅱ型膠原的表達較C組和D組增