1，3-丁二烯職業(yè)暴露人群HPRT基因分子突變機理的初步研究.pdf

1、人類的生存空間中存在著大量的有害外來化合物(包括物理的、化學的與生物的),可能損害人類的遺傳物質(zhì)(染色體、基因與DNA等),誘發(fā)高頻率的突變,進而對人類健康和物種品質(zhì)構成危害.HPRT基因正向突變試驗是國內(nèi)外廣泛采用的突變檢測方法.以往進行HPRT基因的致突變檢測主要有兩種方法,即放射自顯影法與多核細胞檢測法,雖然這兩種方法簡單、快速,但主要的缺陷是不能進一步確定突變細胞的來源(基因突變的定位與定性),這一直是制約HPRT基因突變研究深

2、入發(fā)展的重要因素.突變克隆檢測法由于克服了前兩種方法的主要缺陷而得到日益廣泛的應用,已成為人類HPRT位點研究的最有價值的方法.因此選擇合適的方法"證實人類HPRT基因突變資料和獲取其分子突變譜"已成為今后致突變研究的"最緊迫的任務之一".通過運用上述各種基因突變檢測技術,國際上已積累了大量的有關HPRT基因位點突變的資料,并構建了初步的HPRT位點突變圖譜數(shù)據(jù)庫,國際組織多次倡導進行各種可疑誘變物對不同細胞系在體內(nèi)或體外的致突變檢測,

3、收集盡可能多的HPRT突變圖譜資料,匯集成數(shù)據(jù)庫,為進一步研究突變機理、突變熱點以及體內(nèi)外突變圖譜的比較打下基礎.另一方面,1,3-丁二烯(BD)是一種重要的工業(yè)原料,廣泛用于合成橡膠、塑料等石油化工與制造行業(yè)中.由于發(fā)現(xiàn)BD在汽車尾氣、香煙煙霧以及食用油油煙中普遍存在,因此BD污染危害可能已超出了職業(yè)性范圍.考慮到在很低的暴露水平下(13.75mg/m<'3>)就能引起實驗動物發(fā)生腫瘤,美國最近再次把BD的職業(yè)暴露閾值從22mg/m<

4、'3>降至2.2mg/m<'3>,而我國衛(wèi)生標準定為100mg/m<'3>(1979年),提示現(xiàn)行的衛(wèi)生標準已不足以保護工人及其后代的健康.目前認為BD對動物體細胞和生殖細胞均有致突變作用,并且是肯定的動物致癌物,但迄今為止,有關BD對人的致突變研究報告很少,且存在爭議.因此,本課題首先以幾種理化因素為模型在實驗室建立起HPRT基因突變分析方法,然后利用現(xiàn)場流行病學調(diào)查和實驗室分子生物學研究相結合,以74例BD暴露組工人與157例對照組

5、人群為對象,測定了工作場所空氣中BD含量,調(diào)查受試者一般健康和生活習慣背景,并進行了職業(yè)健康檢查;通過對其外周血淋巴細胞克隆培養(yǎng),測定了231例受試者細胞克隆效率與HPRT基因突變頻率;利用多重PCR技術對783個HPRT基因突變體9個外顯子的缺失情況進行了分析,并進一步采用RT-PCR與cDNA測序研究了146個點突變體,初步探討了BD暴露組工人與對照組人群HPRT基因的分子突變譜及其相關機理.研究內(nèi)容包括三部分:(1)以幾種理化因素

6、為模型在實驗室建立HPRT基因突變分析方法;(2)BD生產(chǎn)車間作業(yè)工人職業(yè)暴露監(jiān)測及相關健康檢查;(3)BD作業(yè)工人淋巴細胞HPRT基因突變頻率及分子突變譜的實驗研究,主要結果如下:1.根據(jù)我們的現(xiàn)場調(diào)查,并參考國內(nèi)外相關研究資料,總結出選擇BD職業(yè)暴露現(xiàn)場的4條標準與2個參考因素,應用于本次研究中,選定符合試驗要求、具有代表性的BD生產(chǎn)現(xiàn)場:南京揚子石化公司烯烴廠BD車間;現(xiàn)場調(diào)查BD車間生產(chǎn)工藝與作業(yè)工人工作流程,結合受試對象一般健

7、康與生活習慣背景資料,選擇BD暴露組與對照組,確定空氣監(jiān)測采樣點,測定BD含量,暴露組工作地點BD含量為20.79±34.95mg/m3,而對照組工作地點均低于檢測下限.本研究方法也可供其它職業(yè)接觸化合物現(xiàn)場調(diào)查時借鑒.2.受試對象職業(yè)健康檢查發(fā)現(xiàn),在涉及神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)的主訴癥狀方面,BD暴露組明顯高于對照組(P<0.05);血液學檢查方面,BD暴露組血紅蛋白明顯低于對照組(P<0.05),并且紅細胞計數(shù)也下降;特殊檢查

8、方面,BD暴露組的心電圖異常比例明顯高于對照組(P<0.05),主要表現(xiàn)為"T波低平".結果提示,BD對職業(yè)暴露人群具有一定的毒性作用,其臨床表現(xiàn)是多方面的,可能在人體內(nèi)存在多種靶器官和組織.3.測定了74例BD作業(yè)工人與157例對照人群的外周血淋巴細胞克隆效率與突變頻率,BD暴露組的細胞克隆效率沒有變化,但突變頻率(18.24±9.35×10<'-6>)比對照組(12.74±7.33×10<'-6>)升高.盡管本次實驗對照組與其它同類

9、研究對照組相比,突變頻率較高,造成本實驗兩組之間統(tǒng)計學差異不顯著,但仍具有實際意義,提示BD對人具有潛在的致突變作用.可以推測國際上對此問題的爭論可能主要來自對照組選擇的不同.4.本試驗測定了415個對照組突變體與368個BD暴露組突變體,對照組突變體中大多數(shù)是點突變(87.5﹪),其比例高于BD暴露組(72.6﹪);但BD暴露組工人外顯子缺失發(fā)生頻率(27.4﹪)明顯高于對照人群(12.5﹪)(P<0.05),其中主要是多外顯子連鎖缺

10、失比例升高(P<0.05).結果表明在外顯子水平BD接觸對職業(yè)人群具有明確的致突變作用.5.本試驗對71個來自對照組的突變體與75個來自BD暴露組的突變體進行了序列分析,BD暴露組單堿基置換發(fā)生率(61.3﹪)明顯低于對照組(80.3﹪),但其中A:T→T:A 顛換發(fā)生率反而明顯高于對照組(P<0.05).BD暴露組±1移碼突變發(fā)生率(22.7﹪)也明顯高于對照組(7.0﹪).結果顯示BD暴露組與對照組在堿基突變譜總體上也存在明顯差別.

11、6.測序中發(fā)現(xiàn)1個新的HPRT基因突變位點:73位點,并在3個已知突變位點上觀察到新的突變類型:149(C→T)、395(T→A)與430(C→T)位點,但這些突變可能是自發(fā)突變事件,而與BD暴露無關.這些結果是首次報導,還需要進一步研究驗證.7.體內(nèi)與體外試驗突變譜比較HPRT基因突變位點在各個外顯子中的分布,未發(fā)現(xiàn)突變熱點,但均有明顯的區(qū)域分布特點,3'端出現(xiàn)突變的數(shù)目要高于中段與5'端.這可能與HPRT基因9個外顯子不同的結構與功

12、能密切相關.目前對于外來化合物誘導HPRT基因突變是否有"熱點"的問題存在爭議.本研究的結果表明,由于外顯子在基因DNA結構上的不均勻分布(偏向于3'端),因此這種爭議可能不是來源于實驗結果的不同,而是比較方法的不同造成的,對于這個突變熱點問題以及相關分子機理下結論還為時過早,有待進一步深入研究.8.本研究以幾種理化因素為模型,在實驗室成功建立起克隆篩檢法結合多重PCR技術的HPRT基因突變分析方法,不僅能進行常規(guī)的HPRT基因突變細胞

13、克隆效率與突變頻率的分析,而且能進一步擴增突變細胞,進行深入的分子突變譜研究,再加上必要的測序工作,那么本方法作為一種深入、系統(tǒng)地研究外來化合物的致突變性及其分子突變機理的方法,不僅為開展BD職業(yè)暴露人群HPRT基因突變分析奠定了方法學基礎,而且具有廣泛的應用前景.總之,通過課題的研究,不僅在分子水平上系統(tǒng)地獲得BD對人具有致突變性的證據(jù),而且為我國重新制定BD職業(yè)暴露衛(wèi)生標準以及職業(yè)防護提供了理論依據(jù);從更大范圍來說,本研究的結果將使