軟腐果膠桿菌不同菌株car基因結(jié)構(gòu)及抗生素合成能力差異分析.pdf

1、胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum，簡(jiǎn)稱(chēng)Pcc)，是一種分布廣泛能引起多種農(nóng)作物和園藝植物軟腐的病原細(xì)菌。其能產(chǎn)生一系列致病因子，如:果膠酶、纖維素酶、蛋白酶等，從而降解寄主植物細(xì)胞壁，使菌體侵入到植物體內(nèi)，不斷吸取營(yíng)養(yǎng)并生長(zhǎng)繁殖;有些菌株還可以產(chǎn)生抗生素，對(duì)環(huán)境中其它細(xì)菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制，提高其環(huán)境競(jìng)爭(zhēng)力。研究表明不同地區(qū)不同寄主分離獲得的軟腐果膠桿菌在

2、致病因子分泌方面具有較大的差異。本研究收集了15株來(lái)自江蘇、湖北、云南等地的不同植物軟腐組織中分離獲得的軟腐果膠桿菌，對(duì)致病性、果膠酶、纖維素酶、蛋白酶、碳青霉烯的活性進(jìn)行了測(cè)定，對(duì)分離于北京、美國(guó)、巴西、英國(guó)的果膠桿菌進(jìn)行碳青霉烯活性測(cè)定。此外，利用全基因組測(cè)序結(jié)果，對(duì)軟腐果膠桿菌不同菌株的碳青霉烯基因簇的差異進(jìn)行分析。通過(guò)構(gòu)建carR基因（碳青霉烯合成調(diào)控基因）的缺失、互補(bǔ)及不同菌株的過(guò)表達(dá)等菌株，比較分析這些菌株的抗生素形成能力的

3、差異，為探究碳青霉烯抗生素合成調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　通過(guò)16S rRNA及四個(gè)看家基因recA、mdh、rpoH、fliA的PCR片段測(cè)序、比對(duì)、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，同時(shí)利用Biolog技術(shù)，對(duì)來(lái)源于江蘇、湖北、云南等地，自君子蘭(jun1、jun2、jun4、jun5、jun6、jun7、jun8、jun9、jun10)、水飛薊(SFJ)、甘藍(lán)(Eg5-1)、白菜(BC)、蘆篙(LH)、魔芋(MY)、半夏(BX)等寄主分離獲

4、得的軟腐果膠桿菌進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示上述菌株均屬于Pcc。
　　致病性和果膠酶、纖維素酶的活性測(cè)定結(jié)果顯示，與PccS1菌株（自南京彩色馬蹄蓮軟腐組織分離獲得）相比，以上鑒定為Pcc的菌株對(duì)白菜的致病力、果膠酶和纖維素酶的活性均無(wú)顯著性差異。蛋白質(zhì)酶活性測(cè)定結(jié)果表明:與PccS1相比，分離于君子蘭(jun1～jun10)、白菜(BC)、魔芋(MY)、半夏(BX)的Pcc菌株產(chǎn)生蛋白質(zhì)酶的活力更強(qiáng)，而分離于甘藍(lán)(Eg5-1)幾乎沒(méi)有

5、產(chǎn)生蛋白質(zhì)酶的能力。碳青霉烯抗生素活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與PccS1相比，jun1～jun10、LH產(chǎn)生碳青霉烯的能力更強(qiáng)，而SFJ、Eg5-1、BC、MY、BX幾乎沒(méi)有產(chǎn)生碳青霉烯的能力。收集于北京的6個(gè)菌株(Ecc71、S7、BC1、QC47、QC142、QC166)和英國(guó)的9個(gè)菌株(252、253、254、255、256、257、258、99、109)的碳青霉烯活性檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果表明:只有258產(chǎn)生碳青霉烯的能力與PccS1無(wú)顯著性差異

6、，而Ecc71、S7、BC1、QC47、QC142、QC166、252、253、254、255、256、257、99、109各菌株均沒(méi)有產(chǎn)生碳青霉烯的能力。
　　為了探究碳青霉烯抗生素合成調(diào)控機(jī)制，對(duì)PccS1的碳青霉烯調(diào)控基因carR進(jìn)行敲除，獲得△carR，carR缺失突變之后不能產(chǎn)生碳青霉烯抗生素，互補(bǔ)菌株△carR(carR)能恢復(fù)碳青霉烯的產(chǎn)生能力。此外，將帶有carR基因的表達(dá)載體導(dǎo)入到不能產(chǎn)生碳青霉烯抗生素的Pcc菌

7、株SFJ、Eg5-1、BC、MY，均能引起碳青霉烯合成能力，不僅對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出良好的抑菌效果，而且能夠較好地抑制DC3000、梨火疫病菌、梨枯梢病菌、青枯病菌、水稻細(xì)菌性條斑病菌等多種作物病原細(xì)菌的生長(zhǎng)。然而，當(dāng)carR基因的表達(dá)載體導(dǎo)入自半夏軟腐組織分離的菌株(BX)中，卻不能產(chǎn)生碳青霉烯。全基因組測(cè)序結(jié)果表明:在能產(chǎn)生碳青霉烯菌株(PccS1、jun1、LH)的基因組中含有carR-H基因，核苷酸序列比對(duì)同源性均高于91％; Eg