用基因芯片技術分析川芎嗪對小鼠潰瘍性結腸炎的影響.pdf

1、本文論述了以基因芯片技術分析川芎嗪對小鼠潰瘍性結腸炎的影響。 炎癥性腸病（IBD）包括潰瘍性結腸炎（UC）和克羅恩?。–D），是免疫、遺傳、環(huán)境及腸道細菌等多因素、多環(huán)節(jié)相互作用的結果，由于病因不明,臨床上常常表現(xiàn)反復發(fā)作而治愈難度大。近年來在CD的治療研究上取得了較大的進展，幾種特異性免疫生物制劑的療效相繼得到肯定。與此同時，對在我國發(fā)病率更高的UC的研究卻大大滯后，一方面原因在于UC的動物模型制取不易，本實驗選用惡唑酮結腸炎

2、模型,為 Th2型炎癥,其組織學特征和炎癥分布均類似人類。另一方面，雖然在運用某些特異性免疫生物制劑包括中醫(yī)藥手段來干預細胞因子網(wǎng)絡以治療UC上也有很多嘗試，但檢測指標多集中于單一或數(shù)個分子上，取材種類也較少，從而使得數(shù)據(jù)較為單薄，難以完整解釋藥物的作用機制。 本實驗采用基因芯片表達譜技術分析川芎嗪對小鼠潰瘍性結腸炎的影響，對川芎嗪藥物的作用機制做出綜合評價，旨在進一步了解潰瘍性結腸炎的發(fā)病機制及提高中藥療效提供有益的思路，為U

3、C的動物模型選取和藥物篩選研究提供實驗依據(jù)。 方法： 1.建立小鼠潰瘍性結腸炎模型及川芎嗪體內(nèi)藥物干預。將40只健康昆明小鼠隨機分為4組：正常對照組（10只）、模型對照組（10只）、生理鹽水組（10只）、川芎嗪組（10只）；除正常組外，其他動物均建立惡唑酮誘導的結腸炎模型：小鼠背部皮膚滴注3％惡唑酮（溶解于100％乙醇中）0.2mL；1d后重復滴注1次。4d后將硅膠管從肛門插入小鼠腸道深約4cm,注入0.5％惡唑酮（溶解

4、于50％乙醇中）0.15mL。灌腸后第2d起對3組動物分別不處理、腹腔注射生理鹽水100ul和川芎嗪8mg/kg（以100ul生理鹽水稀釋）。連續(xù)治療7d后處死所有動物。取離體新鮮結腸組織， -80℃保存。 2.結腸組織大體形態(tài)和組織學評分。取各組小鼠肛門至盲腸段結腸(約8cm)沿腸結膜縱軸剪開,冷生理鹽水沖洗干凈, 用放大鏡觀察大體形態(tài)改變,按無損傷0分,黏膜充血1分,潰瘍面積≤受損面積25％ 2分,潰瘍面積為受損面積25％～

5、50％ 3分,潰瘍面積≥受損面積50％ 4分,為標準評分。取腸組織一部分以10％福爾馬林固定,石蠟包埋,HE染色鏡下評價炎癥和潰瘍,結腸組織學損傷評分指標包括潰瘍、肉芽腫,纖維化按有無及輕重計為0、1、2分,病變深度(達粘膜下層1分、肌層2分、漿膜層3分),各項相加得總分。 3.小鼠基因芯片實驗方法。小鼠結腸樣本總RNA抽提按TRIZOL RNA提取試劑盒說明書提取各樣本總RNA，取等量結腸組織RNA分別于組內(nèi)混合。用瓊脂糖凝膠

6、電泳及Lab-on-chip系統(tǒng)對樣品總RNA進行質(zhì)量檢測和定量。 探針制備： 采用QIAGEN Rneasya Kit（QIAGEN公司，Cat No.74106）分離純化總RNA。mRNA經(jīng)過逆轉錄標記cDNA探針并純化，cDNA第一鏈和第二鏈一步法合成，參入熒光標記NTP，用Cy3-NTP標記鹽水對照組結腸cDNA，用Cy5-NTP標記川穹嗪組結腸cDNA。 芯片雜交和掃描采用小鼠基因芯片為Mouse ol

7、igo microarray（Agilent公司，目錄號：G4112A）。芯片的雜交、洗脫、染色均在Agilent公司專用設備Agilent雜交爐（型號:G2545A）中完成。用Agilent激光共聚焦掃描儀（型號:G2655AA）對雜交結束后的芯片進行掃描。 數(shù)據(jù)讀取與標準化處理圖像直接使用Agilent系統(tǒng)相應的圖像分析軟件Feature Extraction進行定量分析處理。通過對熒光、背景和標準化方式（Linear&Lo

8、wess）等參數(shù)的設定，圖像定量和數(shù)據(jù)標準化處理一步完成。Ratio值為cy3/cy5，差異基因篩選標準為Ratio(Cy3/Cy5)>=2或<=0.5，F(xiàn)lag為0，SN>2.6，pValueLogRatio<0.05。最后使用genespring和cluster分析軟件進行基因聚類分析。 4.統(tǒng)計學方法：所有數(shù)據(jù)均以統(tǒng)計軟件SPSSV13.0進行處理分析，大體評分和組織學以均數(shù)±標準差（±s）表示，大體評分和組織學評分采用成

9、組設計的兩樣本均數(shù)比較的t檢驗, ,定義P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結果： 1.模型制備結果模型組大體評分 2.62±0.29，組織學評分7.94±0.45；正常組大體評分0.18±0.24，組織學評分2.60±1.23，模型組評分較對照組評分增高,差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）符合潰瘍性結腸炎的特征，提示：小鼠UC模型制備成功。 2.結腸組織大體形態(tài)和組織學評分生理鹽水組大體評分2.04±0.11，組織

10、學評分7.01±0.05；川芎嗪組大體評分1.25±0.59，組織學評分3.55±0.29，川芎嗪組用藥7d后可見粘膜充血水腫減輕,潰瘍愈合,腺體增生明顯,鏡下黏膜及黏膜淺層僅有少量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤,大體評分和組織學評分低于生理鹽水組（P<0.05）。 3.差異表達基因Mouse oligo microarray芯片總點樣數(shù)1,2012個點, 根據(jù)Signal log ratio值排列并結合基因的生物學功能以及 Tree

11、view分析,待研基因包含細胞因子、炎性因子、離子通道和運輸?shù)鞍谆?、細胞周期蛋白基因、細胞骨架和運動蛋白基因、細胞凋亡相關蛋白基因、免疫相關基因、細胞信號和傳遞蛋白、代謝基因、蛋白翻譯合成基因、、細胞骨架與動力蛋白基因等。本實驗結果顯示與生理鹽水對照組相比，川芎嗪治療組差異表達基因486個，占芯片基因總數(shù)2.86％，其中上調(diào)基因335個，下調(diào)基因151個，其中部分已知基因的功能，表明川芎嗪可以引起多種基因表達發(fā)生改變, 通過多方面作用

12、途徑在理論上為治療潰瘍性結腸炎提供了可能，但該類藥物更為精細的治療靶點都有待于進一步探索。 結論： 1.川芎嗪通過抗炎癥介質(zhì)，抑制腸道炎癥反應；保護血管內(nèi)皮細胞，改善微循環(huán)；抗黏附分子；修復腸道細胞的穩(wěn)定結構、抗黏附分子及改善免疫功能等多方面作用途徑在理論上為治療潰瘍性結腸炎提供了可能，但該類藥物更為精細的治療靶點都有待于進一步探索。 2.基因芯片技術在藥物作用的分子機理、藥物活性等領域都有其他方法無可比擬的優(yōu)越