苯并[a]芘對(duì)體外培養(yǎng)大鼠神經(jīng)細(xì)胞Hsp70表達(dá)及損傷的研究.pdf

1、目的：
　　 研究苯并[a]芘(B[a]P)對(duì)體外培養(yǎng)大鼠神經(jīng)細(xì)胞熱休克蛋白70(Hsp70)表達(dá)的影響及其與細(xì)胞損傷的關(guān)系，探討Hsp70在B[a]P神經(jīng)毒性中的作用，為B[a]P神經(jīng)毒性的防治提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 取新生1～3天的SD大鼠，在無菌條件下取出腦皮質(zhì)并用0.25％胰酶消化，以1×106密度接種神經(jīng)細(xì)胞。分別以終濃度0、0.1、0.5、1、5、10、50、100μmol/L劑量B[a]P和

2、0、0.1、0.5、1、5、10μmol/L劑量B[a]P+S9對(duì)神經(jīng)細(xì)胞染毒24小時(shí)，觀察B[a]P+S9對(duì)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變及對(duì)Hsp70表達(dá)影響的劑量反應(yīng)關(guān)系。分別以0、0.5、5μmol/L劑量B[a]P+S9染毒神經(jīng)細(xì)胞24、48、72小時(shí)，觀察B[a]P+S9對(duì)Hsp70表達(dá)影響的時(shí)效關(guān)系。Westem blot法測定Hsp70的表達(dá)，熒光免疫組織化學(xué)法觀察神經(jīng)細(xì)胞Hsp70表達(dá)及定位。光鏡觀察神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，MTT法

3、檢測細(xì)胞活力，試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、MDA的含量，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，單細(xì)胞凝膠電泳檢測細(xì)胞DNA損傷情況，曲線擬合法分析Hsp70與細(xì)胞損傷的相關(guān)關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 B[a]P和B[a]P+S9均可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞Hsp70表達(dá)出現(xiàn)隨著劑量的增大先升高后下降的趨勢(shì)，B[a]P在50μmol/L時(shí)Hsp70表達(dá)達(dá)峰值，100μmol/L時(shí)Hsp70表達(dá)顯著下降；而B[a]P+S9僅在0.1μmol/L

4、劑量染毒時(shí)出現(xiàn)小幅升高后即隨著劑量的增大而顯著下降，其中，10μmol/L組神經(jīng)細(xì)胞Hsp70表達(dá)值(0.10±0.05)顯著低于0μmol/L組(0.28±0.05，P＜0.05)，0.5、1、5、10μmol/L組Hsp70表達(dá)值(0.23±0.05、0.21±0.15、0.16±0.10和0.10±0.05)均顯著低于0.1μmol/L組(0.41±0.11，P＜0.05)；時(shí)效關(guān)系研究結(jié)果顯示，0.5、5μmol/LB[a]P+

5、S9染毒神經(jīng)細(xì)胞，均隨著染毒時(shí)間的延長，Hsp70表達(dá)值有下降趨勢(shì)，72小時(shí)時(shí)的神經(jīng)細(xì)胞組Hsp70表達(dá)值(0.28±0.15和0.17±0.03)均顯著低于24小時(shí)(0.36±0.03和0.25±0.02，P＜0.05)；顯示B[a]P代謝產(chǎn)物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞Hsp70表達(dá)有抑制作用。免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組Hsp70僅在細(xì)胞漿中表達(dá)，0.1μmol/L組熒光表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞漿和核中均有表達(dá)。隨著劑量增大，核內(nèi)表達(dá)逐漸增多，但熒光表達(dá)強(qiáng)度減弱

6、。
　　 對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的檢測結(jié)果顯示：隨著B[a]P+S9劑量的增大，神經(jīng)細(xì)胞的軸突和樹突的數(shù)量減少、突觸長度縮短和神經(jīng)細(xì)胞間和細(xì)胞與突觸間的連接數(shù)量減少。部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡化，染色質(zhì)凝聚成塊狀。細(xì)胞活力隨著劑量升高而降低，1、5、10μmol/L組MTT OD值(0.50±0.45、0.49±0.28和0.47±0.25)顯著低于對(duì)照組(0.65±0.81，P＜0.05)。細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力和MDA含量、細(xì)胞凋亡率、彗星尾

7、長和尾矩均隨著劑量升高而升高。1、5、10μmol/L組LDH活力和MDA含量(520.2±11.6、540.5±40.6、588.4±63.7u/L和1.61±0.08、1.65±0.06、1.67±0.13nmol/ml)顯著高于對(duì)照組(321.5±36.8u/L和1.38±0.06nmol/ml，P＜0.05)。0.1、0.5、1、5、10μmol/L組的早期凋亡率和總凋亡率(3.36±0.55、4.73±0.50、6.5±0.7

8、1、8.2±0.75、10.43±0.73和3.47±0.56、4.83±0.39、6.65±0.63、8.44±1.09、10.57±0.83)均顯著高于對(duì)照組(2.13±0.25和2.18±0.23，P＜0.05)。0.5、1、5、10μmol/L組彗星尾長和尾矩(4.85±3.19、14.79±5.62、36.23±4.97、62.82±8.85μm和1.8±2.95、6.23±4.58、12.78±8.89、24.72±17.4

9、1)顯著高于對(duì)照組(2.97±1.02μm和0.81±0.37，P＜0.05)。
　　 用曲線擬合法分析神經(jīng)細(xì)胞Hsp70表達(dá)值與細(xì)胞損傷的關(guān)系顯示，Hsp70表達(dá)值與LDH、MDA呈直線相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r分別為0.857(P＜0.05)和0.828(P＜0.05)。Hsp70表達(dá)值與細(xì)胞凋亡率和彗星尾矩呈二次曲線擬合，R2分別為0.917(P＜0.05)和0.987，(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 較