線粒體MEF2D氧化修飾水平變化在PD發(fā)病中的作用.pdf

1、帕金森病（PD）是一種神經(jīng)退行性疾病，其主要臨床特征是嚴重影響患者的運動功能。隨著我國逐漸進入老齡化時代，PD越來越受到家庭與社會的關注[1,2]。PD的主要病理學特點是中腦SNc區(qū)DA神經(jīng)元發(fā)生變性和死亡，導致多巴胺的釋放減少，但DA神經(jīng)元變性死亡的具體機制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，約5％-10%的PD例明確是和遺傳因素相關的，這部分病例與特定的基因改變有關[3]，而大多數(shù)PD病例是散發(fā)的，其確切的發(fā)病原因還不明確。流行病學研究已經(jīng)證明特定

2、的環(huán)境因素暴露（如神經(jīng)毒劑）和PD的發(fā)病之間有確定的聯(lián)系[4]，表明部分神經(jīng)毒劑會導致或促進PD發(fā)病。現(xiàn)在有一個被廣泛認同的觀點是：遺傳與環(huán)境因素共同作用于細胞，破壞細胞穩(wěn)態(tài)并導致了氧化應激，繼而造成了DA神經(jīng)元的死亡，這其中一個關鍵的靶點是線粒體。越來越多的實驗數(shù)據(jù)表明，家族遺傳性PD中一些基因的突變可能是通過影響線粒體功能而產(chǎn)生致病效果，同樣，一些毒劑也是通過這個途徑導致PD發(fā)病。但是目前對線粒體功能紊亂、氧化應激級聯(lián)反應、蛋白聚集

3、和誘發(fā)神經(jīng)元死亡的關鍵分子及信號通路缺乏進一步的了解，妨礙了PD的診斷治療，特別是早期發(fā)現(xiàn)疾病。神經(jīng)影像學、基因組學和系統(tǒng)生物學的方法在反映疾病的發(fā)展和變化上仍存在較多的限制和障礙[5]。在發(fā)病機制深入研究基礎上，探索一種可靠、敏感的PD生物學標記物成為目前急需解決的關鍵問題。
　　肌細胞增強因子2（MEF2）最早在骨骼肌的相關研究中被發(fā)現(xiàn)，后來被證實在越來越多的方面發(fā)揮自己特有的作用。MEF2D已被證實與神經(jīng)元存活密切相關[6,

4、7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，轉錄因子MEF2D對于DA神經(jīng)元的存活起關鍵性作用[6]，不同的細胞應激能夠通過相應的信號通路調節(jié)MEF2D的功能，對神經(jīng)元的存活產(chǎn)生影響。MEF2D在DA神經(jīng)元線粒體中表達，并參與呼吸鏈復合體I活性的調節(jié)[7]。在線粒體中，MEF2D特異性調節(jié)線粒體NADH脫氫酶6（ND6）基因的轉錄表達。ND6是唯一由線粒體輕鏈編碼的蛋白質，在呼吸鏈復合體 I組裝過程中發(fā)揮著必不可少的作用；降低線粒體MEF2D表達水平會

5、明顯抑制呼吸鏈復合體I的功能，導致細胞內過氧化物水平升高，誘發(fā)神經(jīng)元死亡[8]，而大量表達線粒體靶向MEF2D時可以保護神經(jīng)毒素誘發(fā)的DA神經(jīng)元死亡。現(xiàn)有研究結果提示：線粒體MEF2D對與線粒體功能具有重要調控作用，MEF2D與其氧化修飾水平對于把金森并的發(fā)病過程具有重要影響。
　　本研究采用小鼠MPTP-PD亞急性模型，探索在PD模型中，DA神經(jīng)元線粒體MEF2D表達水平以及氧化修飾水平的動態(tài)變化；研究MEF2D、ND6以及線粒

6、體功能變化與DA神經(jīng)元損傷的關系；通過與其他轉錄因子對比，初步分析線粒體MEF2D及其氧化修飾水平作為PD生物學標記物的可行性。
　　實驗一：MPTP-PD模型中動態(tài)檢測線粒體MEF2D水平變化
　　方法
　　（1）建立小鼠 MPTP-PD亞急性模型，實驗動物隨機分為4組：Con（對照）組，D1（給藥第1天）組，D3（給藥第3天）組，D5（給藥第5天）組，D1、D3和D5組為實驗組。實驗組小鼠按30mg/kg劑量腹腔注

7、射MPTP，注射時間為上午9點，每天一次，連續(xù)5天，對照組于同時間注射同等劑量0.9%生理鹽水。（2）在給藥的當天下午3點處死D1組小鼠，第3天同時間點處死D3組小鼠，第5天同時間點處死 Con組和D5組小鼠，分別收取樣本。（3）使用免疫熒光染色法動態(tài)檢測小鼠中腦 DA神經(jīng)元水平變化情況。（4）分離細胞質、細胞核以及線粒體，使用免疫印跡法檢測分離純化效果。（5）使用免疫印跡法動態(tài)檢測小鼠中腦 DA神經(jīng)元細胞核和線粒體MEF2D水平變化情

8、況。（6）分離小鼠的小腦，皮層，紋狀體，使用免疫印跡法分別檢測各腦區(qū)線粒體MEF2D水平變化情況。
　　結果:
　?。?）免疫熒光結果顯示，在給藥的第1、3、5天中，與對照組相比，小鼠黑質致密部 DA神經(jīng)元水平出現(xiàn)不同程度顯著下降，在給藥第5天幾乎消失殆盡，證明小鼠MPTP-PD亞急性模型建立成功。（2）免疫印跡結果顯示細胞質，細胞核以及線粒體分離效果良好，相互之間沒有混雜或污染，達到實驗要求。（3）在給藥的1、3、5天中，

9、細胞核MEF2D水平?jīng)]有出現(xiàn)明顯變化，而同區(qū)域的線粒體MEF2D在給藥的第一天即出現(xiàn)明顯下降（P<0.05），并在第3天和第5天出現(xiàn)顯著下降（P<0.01）。（4）小鼠小腦，皮層，紋狀體線粒體MEF2D水平在給藥的1、3、5天中沒有出現(xiàn)明顯變化，只有黑質區(qū)線粒體MEF2D水平與對照組相比明顯降低（P<0.05）。
　　結論:
　?。?）在PD模型中，小鼠黑質區(qū)線粒體 MEF2D水平變化與同時間點中腦 DA神經(jīng)元損失水平相一致

10、，能夠較好地反映 DA神經(jīng)元水平變化情況。（2）小鼠黑質區(qū)線粒體MEF2D水平變化并不是由非特異性應激反應所引起，其變化水平與DA神經(jīng)元受損程度密切相關。
　　實驗二：MPTP-PD模型中動態(tài)觀測核轉錄因子Nurr1和線粒體轉錄因子TFAM的水平變化
　　方法:
　?。?）同實驗一建立小鼠MPTP-PD亞急性模型，隨機分為4組：Con組，D1組，D3組，D5組。（2）使用免疫印跡法檢測小鼠中腦DA神經(jīng)元Nurr1和TF

11、AM動態(tài)水平變化。
　　結果:
　?。?）在PD模型中，小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元細胞核轉錄因子Nurr1在給藥的第1、3、5天中沒有出現(xiàn)明顯的變化，同區(qū)域線粒體轉錄因子TFAM在給藥的第1天和第3天沒有明顯變化，第5天時出現(xiàn)明顯下降（P<0.05）。
　　結論:
　　（1）在PD模型中，細胞核轉錄因子Nurr1和線粒體轉錄因子TFAM這兩種重要的存活相關轉錄因子對于多巴胺能神經(jīng)元的水平變化都不夠敏感，線粒體MEF2

12、D相比于Nurr1和TFAM，對于多巴胺能神經(jīng)元的損傷更加敏感，能夠更好地反映多巴胺能神經(jīng)元的受損程度。
　　實驗三：觀察線粒體MEF2D氧化修飾水平與DA神經(jīng)元線粒體功能變化的相關性
　　方法:
　　（1）同實驗一建立小鼠MPTP-PD亞急性模型，隨機分為4組：Con組，D1組，D3組，D5組。（2）使用OxyBlot技術檢測線粒體MEF2D氧化修飾水平動態(tài)變化。（3）使用qRT-PCR技術檢測ND6 mRNA水平的

13、動態(tài)變化。（4）通過測定在450nm下NADH的氧化速率檢測呼吸鏈復合體I活性的動態(tài)變化。
　　結果:
　　（1）在PD模型中，與對照組相比，中腦DA神經(jīng)元線粒體MEF2D氧化修飾水平自給藥第3天開始出現(xiàn)明顯升高，在給藥的1、3、5天中呈逐漸升高趨勢。（2）同區(qū)域 ND6 mRNA水平在給藥第3天明顯下降（P<0.05），在第5天顯著下降（P<0.01）。（3）同區(qū)域Complex I活性在第3天和第5天時出現(xiàn)顯著下降（P<