高糖誘導(dǎo)Bim蛋白高表達(dá)而促腎近曲小管上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制探討.pdf

1、目的：
　　擬以人腎近曲小管上皮細(xì)胞(human proximal tubular epithelialcells，HK-2細(xì)胞)為對(duì)象，研究高糖環(huán)境下Bim與HK-2細(xì)胞凋亡的關(guān)系，并在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究自噬在其中所起的作用。
　　方法：
　　1.第一步
　　用不同糖濃度處理HK-2細(xì)胞，檢測(cè)其中Bim蛋白的表達(dá)情況，及細(xì)胞凋亡和自噬的情況。
　　1.1.細(xì)胞分組及培養(yǎng)
　　將HK-2細(xì)胞系分為兩

2、組:NG組即正常糖對(duì)照組（5.5mmol/L D-無水葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇）和HG組即高糖試驗(yàn)組（30.0mmol/L D-無水葡萄糖）。在1640培養(yǎng)基、37℃及含5％CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，擬設(shè)0h、24h、48h這三個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)。
　　1.2.檢測(cè)Bim mRNA及蛋白表達(dá)
　　利用RT-PCR法檢測(cè)Bim mRNA表達(dá)、Western Blot法檢測(cè)Bim蛋白表達(dá)。
　　1.3.檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況<

3、br>　　利用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的比例;利用Western Blot法檢測(cè)active-caspase3蛋白表達(dá)，以間接反映細(xì)胞凋亡的情況。
　　1.4.檢測(cè)細(xì)胞自噬的情況
　　利用Western Blot法檢測(cè)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值，反映細(xì)胞自噬的情況。
　　2.第二步
　　用轉(zhuǎn)染Bim siRNA的方式下調(diào)Bim蛋白表達(dá)，用轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒的方式上調(diào)Bim蛋白表達(dá)，在此基礎(chǔ)上分析HK-2細(xì)胞凋亡、自

4、噬的情況。
　　2.1.細(xì)胞培養(yǎng)及分組
　　NG組和HG組的HK-2細(xì)胞分別分為以下四組:siNC組（轉(zhuǎn)染無意義siRNA）、sibim組（轉(zhuǎn)染Bim siRNA）、sibim+質(zhì)粒組（轉(zhuǎn)染Bim siRNA和siRNA-resistant質(zhì)粒）、質(zhì)粒組（轉(zhuǎn)染Bim過表達(dá)質(zhì)粒）。
　　2.2.檢測(cè)Bim蛋白表達(dá)
　　利用Western Blot法檢測(cè)Bim蛋白表達(dá)。
　　2.3.檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況
　

5、　利用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例;利用Western Blot法檢測(cè)active-caspase3蛋白表達(dá)，間接反映細(xì)胞凋亡的情況。
　　2.4.檢測(cè)細(xì)胞自噬的情況
　　利用Western Blot法檢測(cè)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值，反映細(xì)胞自噬的情況。
　　3.第三步
　　在用Bim siRNA抑制Bim蛋白表達(dá)的前提下，下調(diào)自噬活性，分析HK-2細(xì)胞凋亡的情況。
　　3.1.細(xì)胞培養(yǎng)及分組
　　

6、將HG組中的sibim亞組HK-2細(xì)胞分為兩組:對(duì)照組即DMSO組(只加入3-MA的溶媒DMSO)和試驗(yàn)組即3-MA組（加入3-MA）。
　　3.2.檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況
　　利用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例;利用Western Blot法檢測(cè)active-caspase3蛋白表達(dá)，間接反映細(xì)胞凋亡的情況。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。兩組數(shù)據(jù)的比較應(yīng)用學(xué)生t檢驗(yàn)(student's t te

7、st)。多組間的比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA)。數(shù)據(jù)采用mean±SEM表示，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.高濃度葡萄糖組HK-2細(xì)胞凋亡和Bim蛋白表達(dá)增加對(duì)照組HK-2細(xì)胞不管是24小時(shí)還是48小時(shí)，其TUNEL染色陽性的細(xì)胞均微乎其微;而高糖組，其TUNEL染色陽性的細(xì)胞比例比對(duì)照組明顯增多，而且隨高糖培養(yǎng)時(shí)間的延長，凋亡細(xì)胞增多的趨勢(shì)越來越明顯。應(yīng)用單

8、因素方差分析的方法(One-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，可以發(fā)現(xiàn)高糖組24小時(shí)的細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組同時(shí)間的細(xì)胞凋亡率比較或是與同濃度0時(shí)的細(xì)胞凋亡率比較，均有顯著性差異，其P值均＜0.05;而高糖組48小時(shí)的細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組同時(shí)間的細(xì)胞凋亡率比較或是與同濃度0時(shí)的細(xì)胞凋亡率比較，也有顯著性差異，其P值分別＜0.05和＜0.01。用western blot方法檢測(cè)active-Caspase3蛋白的表達(dá)量也可以發(fā)現(xiàn)相同的規(guī)律。<

9、br>　　高糖培養(yǎng)組HK-2細(xì)胞隨著時(shí)間的延長，其BimEL蛋白的表達(dá)逐漸升高;而對(duì)照組24小時(shí)、48小時(shí)均未見BimEL蛋白的表達(dá)的增加。Bim蛋白的另一種主要異構(gòu)體BimL的表達(dá)量也隨著高糖培養(yǎng)的時(shí)間逐漸增加。用單因素方差分析處理數(shù)據(jù)統(tǒng)顯示:高糖培養(yǎng)24小時(shí)HK-2細(xì)胞BimEL蛋白的表達(dá)較同等培養(yǎng)時(shí)間的對(duì)照組顯著增加(P＜0.05)，較高糖刺激前顯著增加(P＜0.05);HK-2細(xì)胞經(jīng)高糖培養(yǎng)48小時(shí)其BimEL蛋白的表達(dá)較同等培

10、養(yǎng)時(shí)間的對(duì)照組顯著增加(P＜0.01)，較高糖培養(yǎng)前顯著增加(P＜0.01)。
　　高糖培養(yǎng)下HK-2細(xì)胞Bim mRNA的水平明顯增加。高糖培養(yǎng)24小時(shí)Bim mRNA相對(duì)水平較高糖培養(yǎng)前和相同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組均顯著增加（P值均＜0.01），高糖培養(yǎng)48小時(shí)Bim mRNA相對(duì)水平也較高糖培養(yǎng)前和相同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組顯著增加（P值均＜0.01）。
　　用western blot法檢測(cè)LC3蛋白的兩種形式LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ及

11、其比值（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）。發(fā)現(xiàn)不管是高糖組還是對(duì)照組，培養(yǎng)24小時(shí)還是48小時(shí)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均較低，也就是說細(xì)胞的自噬始終處于一個(gè)較低的水平，高糖組的自噬較對(duì)照組并沒有見到明顯的改變。
　　2.Bim蛋白對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡和自噬的影響
　　和無意義siRNA組（siNC組）組對(duì)比，有效的siRNA的轉(zhuǎn)染(siBim組)將內(nèi)源性Bim蛋白抑制到了原有水平的21％。在同樣高糖培養(yǎng)48小時(shí)的條件下，下調(diào)Bim

12、組（siRNA組）的HK-2細(xì)胞的凋亡比例沒有增加;而siNC組細(xì)胞凋亡的比例明顯增加。我們應(yīng)用了siRNA-resistant Bim(Bim-res)質(zhì)粒與siRNA共轉(zhuǎn)染來排除脫靶現(xiàn)象。siBim組高糖培養(yǎng)后下降的凋亡細(xì)胞的比例，在給予Bim-res質(zhì)粒后又恢復(fù)了，siBim加Bim-res組比siBim組凋亡細(xì)胞的比例顯著增加(P＜0.05)。
　　我們將正常糖對(duì)照的HK-2細(xì)胞分成兩個(gè)小組，一組正常培養(yǎng)（對(duì)照組），一組轉(zhuǎn)

13、染BimEL蛋白過表達(dá)質(zhì)粒，培養(yǎng)48小時(shí)后，用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞較對(duì)照組凋亡細(xì)胞的比例明顯增加。
　　我們?cè)谡Ｆ咸菨舛扰囵B(yǎng)的HK-2細(xì)胞中用siRNA下調(diào)Bim，培養(yǎng)48小時(shí)，可見LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯升高，由1.0上升到了2.0，而用拮抗siRNA的Bim-res質(zhì)粒與siRNA共轉(zhuǎn)染后，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值又下降到了1.1。在30mmol/L葡萄糖組，用siRNA下調(diào)HK-2細(xì)胞

14、Bim，培養(yǎng)48小時(shí)，可見0時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值分別是:1.0、2.2、3.0，意味著下調(diào)Bim后，隨著時(shí)間的延長，細(xì)胞的自噬程度逐漸增強(qiáng);而將Bim-res質(zhì)粒與siRNA共轉(zhuǎn)染后，0時(shí)、48小時(shí)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值分別是:1.0、1.3，表明去除下調(diào)Bim的因素后，48小時(shí)的高糖培養(yǎng)，細(xì)胞自噬程度并沒有明顯的改變。
　　3.抑制自噬增加了HK-2細(xì)胞的凋亡
　　我們將轉(zhuǎn)染了針對(duì)于Bim的

15、siRNA的HK-2細(xì)胞，培養(yǎng)2天后，再給予高糖（30mmol/L葡萄糖）培養(yǎng)，然后分成兩組:試驗(yàn)組（3-MA組）加用自噬抑制劑3-MA;對(duì)照組（DMSO組）只給予3-MA的溶媒二甲基亞砜(DMSO)。我們可以看到，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，不管是24小時(shí)還是48小時(shí)，細(xì)胞凋亡比例均明顯增加（用TUNEL法檢測(cè)）;Western Blot法檢測(cè)active-caspase3表達(dá)也可以發(fā)現(xiàn)同樣的規(guī)律。
　　結(jié)論：
　　1.我們的研究

16、首次通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖可以引起腎近曲小管上皮細(xì)胞凋亡增加，而且隨著高糖培養(yǎng)的時(shí)間的延長，細(xì)胞凋亡逐漸增多。
　　2.高糖通過上調(diào)Bim蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)腎近曲小管細(xì)胞凋亡的，而Bim蛋白上調(diào)伴隨著基因轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)。
　　3.細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)下的自噬水平較低。高糖誘導(dǎo)Bim蛋白表達(dá)增加從而引起腎小管上皮細(xì)胞凋亡增加的機(jī)制與細(xì)胞自噬程度的改變關(guān)系不大，有可能是Bim通過Bax/Bak介導(dǎo)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。

17、>　　4.通過下調(diào)Bim，HK-2細(xì)胞能夠恢復(fù)被Bim抑制的自噬，從而發(fā)揮自噬對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。也就是說，下調(diào)Bim蛋白的表達(dá)，除了直接影響凋亡途徑外，還能增加細(xì)胞自噬，從而抑制細(xì)胞凋亡。
　　5.抑制自噬本身可以增加細(xì)胞凋亡，此時(shí)Bim已被siRNA下調(diào)，所以這個(gè)過程是不依賴于Bim蛋白的。
　　主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)：
　　1.我們的研究首次證明了高濃度葡萄糖可以通過上調(diào)Bim蛋白表達(dá)從而引起腎小管上皮細(xì)胞凋亡增加，并且隨著高