抵抗素與CD40在血栓性疾病中的關(guān)聯(lián).pdf

1、背景：
　　血栓性疾病包括（急性心肌梗死、動(dòng)脈粥樣硬化、深靜脈血栓等）已成為威脅全人類(lèi)健康的首要因素之一。其致死、致殘率均極高。經(jīng)研究證實(shí)，血管內(nèi)皮功能障礙、凝血、纖溶系統(tǒng)功能失調(diào)是引起血管內(nèi)血栓形成的重要病理過(guò)程。抵抗素（Resistin）為新近發(fā)現(xiàn)的一種脂肪細(xì)胞因子，因其具有胰島素抵抗作用而得名。現(xiàn)有研究結(jié)果證實(shí)，抵抗素的作用不僅與胰島素抵抗、2型糖尿病、肥胖等密切相關(guān)，而且在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中也起到重要作用。經(jīng)研究證實(shí)，

2、血漿高抵抗素水平是急性心肌梗死等血栓相關(guān)疾病的危險(xiǎn)因素。此外，抵抗素也可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞素-1（endothelin-1, ET-1）、血管性血友病因數(shù)（von Willebrand factor, vWF）、血管細(xì)胞間粘附分子（vascular cell adhension molecule, VCAM）等的分泌表達(dá)，造成血管內(nèi)皮功能障礙，從而參與血栓性疾病的發(fā)生與發(fā)展。
　　本課題組前期研究結(jié)果證明，在體外組織型纖溶酶原激活物

3、-1（plasminogen activator inhibitor-1）的表達(dá)在基因及蛋白水平上均產(chǎn)生一定影響，并進(jìn)一步證實(shí)了抵抗素干預(yù)后血管內(nèi)皮細(xì)胞絲裂元活化激酶（mitogen avtivated protein kinase, MAPK）通路的啟動(dòng)與PAI-1的表達(dá)有一定的關(guān)系，初步揭示了抵抗素的細(xì)胞內(nèi)作用因素，為血栓性疾病的防治提供了新的思路及理論依據(jù)。但目前尚未發(fā)現(xiàn)抵抗素的胞膜作用位點(diǎn)。
　　CD40是Ⅰ型跨膜蛋白受體

4、，是腫瘤壞死因數(shù)超家族的一員，B細(xì)胞是表達(dá) CD40的主要細(xì)胞，但其他細(xì)胞，如上皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞等也表達(dá) CD40。CD40L為 CD40的配體，通過(guò)與CD40的結(jié)合啟動(dòng)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而引發(fā)一系列生物效應(yīng)。
　　近年來(lái)已被證實(shí) CD40/CD40L系統(tǒng)的啟動(dòng)在心肌梗死等血栓性疾病起到重要的作用。因此 CD40/CD40L系統(tǒng)也成為心血管研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。目前已知在參與動(dòng)脈粥樣斑塊形成的多種細(xì)胞

5、中CD40/ CD40L高表達(dá)，但其具體作用還未闡明?，F(xiàn)已知在動(dòng)脈粥樣硬化形成的起始階段，CD40/ CD40L能使內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞活化并且能增強(qiáng)其他粘附因子的表達(dá)。且最近研究結(jié)果表明 CD40/ CD40L能增強(qiáng)在血管比重的樹(shù)突狀細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞的相互作用。CD40L能促進(jìn)頸動(dòng)脈及冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟和T淋巴細(xì)胞的滲入，這都是使粥樣斑塊不穩(wěn)定的特征。
　　且查閱文獻(xiàn)得知，在 CD40/CD40L系統(tǒng)啟動(dòng)后，

6、也是通過(guò)啟動(dòng) MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，且現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，在抵抗素的作用下內(nèi)皮細(xì)胞CD40的表達(dá)升高。
　　由此本課題組成員大膽假設(shè)，抵抗素可能是通過(guò)與胞膜上的CD40相互作用，啟動(dòng)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，繼而在血栓性疾病的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中起到一定作用。
　　目的：
　　因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs），觀察單獨(dú)抵

7、抗素作用下，及在 CD40抗體將 CD40封閉前提下再加入抵抗素作用，對(duì)t-PA, PAI-1表達(dá)的影響，并進(jìn)一步測(cè)定MAPK通路活化情況進(jìn)而推測(cè)CD40是否為抵抗素位于細(xì)胞膜上的作用位點(diǎn)或作用位點(diǎn)之一。
　　*本實(shí)驗(yàn)所采用抵抗素濃度為本課題組前期篩選出的最佳作用濃度
　　方法：
　　1. HUVECs3-4代分為單純培養(yǎng)基對(duì)照組、抵抗素組（50ng/ml）、CD40抗體組、CD40抗體（2ug/mg,提前孵育0.5h

8、）+抵抗素組培養(yǎng)48小時(shí)后，ELISA法測(cè)各組上清中t-PA和PAI-1蛋白含量；
　　2. HUVECs3-4代分為單純培養(yǎng)基對(duì)照組、抵抗素組（50ng/ml）、CD40抗體組、CD40抗體（2ug/mg,提前孵育0.5h）+抵抗素組培養(yǎng)48小時(shí)后，提取 RNA以 real time RT-PCR法測(cè)定各組t-PA和PAI-1的RNA含量。
　　*CD40作用時(shí)間及濃度為查閱文獻(xiàn)所得
　　結(jié)果：
　　1.抵抗素

9、單獨(dú)作用組與CD40抗體+抵抗素作用組相比，在抵抗素作用48h后，t-PA蛋白表達(dá)在 CD40+抗體組較抵抗素組相比無(wú)顯著變化，PAI-1蛋白表達(dá)在 CD40+抗體組較抵抗素組相比下調(diào)（P<0.05）。
　　2.抵抗素單獨(dú)作用組與CD40抗體+抵抗素作用組相比，在抵抗素作用48h后，t-PA基因表達(dá)在 CD40+抗體組較抵抗素組相無(wú)顯著影響，PAI-1基因表達(dá)在 CD40+抗體組較抵抗素組相比下調(diào)（P<0.05）。
　　結(jié)論