子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型建立及2,3,7,8-四氯二苯并二惡英對(duì)內(nèi)膜組織中細(xì)胞色素芳香化酶P450表達(dá)的影響.pdf

1、目的：2，3，7，8-四氯二苯并二惡英(2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)屬于多氯代二苯并二惡英(polychlorinated dibenzo-dioxins)類化合物，是環(huán)境中毒性最大的化合物之一，可以通過多種途徑進(jìn)入人體損害人的健康。子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)是婦科的常見病，以盆腔疼痛、月經(jīng)不調(diào)及不孕為主要特征，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。近年來大量研究資料表

2、明TCDD和EMs的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)暴露在TCDD中不僅可以導(dǎo)致EMs的發(fā)生，還能夠通過擾亂機(jī)體內(nèi)環(huán)境加快EMs的發(fā)展。然而迄今為止，TCDD和EMs之間相互作用的機(jī)制還不十分清楚。EMs屬于雌激素依賴性疾病，雌激素對(duì)于EMs而言起著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞色素芳香化酶P450(cytochrome P450 aromatase，P450arom)是雌激素合成中的限速酶，在EMs中通過合成雌激素發(fā)揮重要作用。因此，我們推測(cè)TCDD

3、影響EMs發(fā)生發(fā)展的途徑之一可能是其促進(jìn)了P450arom的表達(dá)從而使雌激素的合成增加。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠EMs模型，并使用不同劑量的TCDD對(duì)小鼠進(jìn)行宮內(nèi)、宮外暴露或?qū)m內(nèi)宮外聯(lián)合暴露，統(tǒng)計(jì)小鼠模型中異位灶的成活率，同時(shí)檢測(cè)小鼠建模前后在位內(nèi)膜及建模后異位內(nèi)膜中P450arom的表達(dá)程度，以研究TCDD對(duì)小鼠EMs建模成功率的影響及其與P450arom之間互相作用的分子機(jī)制，為EMs的發(fā)病機(jī)理奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和提供理論依據(jù)。

4、
　　 方法：建立小鼠EMs模型，使用TCDD對(duì)其進(jìn)行宮內(nèi)、宮外或?qū)m內(nèi)宮外聯(lián)合暴露，根據(jù)TCDD暴露的方式和劑量將小鼠模型分為五個(gè)小組：0-0組，3-0組，0-3組，3-3組和3-10組。觀察并統(tǒng)計(jì)小鼠模型中皮下、腹膜和卵巢三處內(nèi)異灶的成活情況，并采用RT-PCR技術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)建模前后小鼠模型在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中P450arom的表達(dá)水平，探討其與TCDD在EMs發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)關(guān)系。
　　 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SP

5、SS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行異位灶成活率的比較，成活率的組內(nèi)和組間比較需校正α，分別被校正為0.0125和0.0045；采用單因素方差分析、SNK法(方差齊時(shí))和非參數(shù)檢驗(yàn)(方差不齊時(shí))進(jìn)行P450arom表達(dá)情況的組間及組內(nèi)比較，按α=0.05標(biāo)準(zhǔn)，P<0.05具有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、小鼠EMs建模后皮下、腹膜和卵巢三個(gè)部位異位灶總的成活率(即三個(gè)部位異位灶

6、中最少有一處成活的概率)為100％(60/60)，其中在五個(gè)組中，卵巢異位灶的成活率最高，為83％(50/60)；腹膜、皮下異位灶次之，分別為53％(32/60)和35％(21/60)；三個(gè)部位異位灶的同時(shí)成活率為20％(12/60)。據(jù)卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在五個(gè)組中，皮下、腹膜和卵巢三個(gè)部位異位灶的成活率是有差別的(X2=29.187，P=0.000<0.0125)，其中皮下和腹膜異位灶的成活率和卵巢相比有顯著性差異(X2=29.008

7、，P=0.000<0.0125；)(X2=12.478，P=0.000<0.0125)，皮下異位灶和腹膜異位灶的成活率不具有顯著性差異(X2=4.089，P=0.043>0.0125)。在腹膜部位的異位灶中，3-3組異位灶種植的成功率與對(duì)照組(0-0組)相比具有顯著意義(X2=8.224，P=0.004<0.0045)，其余各組之間的種植成功率不具有顯著性差異(P>0.0045)；皮下和卵巢異位灶中五個(gè)組之間的種植成活率不具有顯著性差異

8、(皮下：X2=5.421，P=0.247>0.0045；卵巢：X2=9.673，P=0.058>0.0045)。
　　 2、P450arom mRNA在建模前后五個(gè)組的在位和異位內(nèi)膜中的表達(dá)
　　 2.1 P450arom mRNA在建模前五個(gè)組的在位內(nèi)膜中的表達(dá)
　　 根據(jù)方差分析結(jié)果顯示，建模前P450arom mRNA在五個(gè)組的子宮內(nèi)膜中的表達(dá)是不同的，差異具有顯著性(P=0.000)，P450arom m

9、RNA在0-0組，3-0組，0-3組，3-3組，3-10組中的表達(dá)依次升高：即0-0組(0.0495±0.0031)，3-0組(0.0612±0.079)，0-3組(0.0814±0.073)，3-3組(0.0926±0.042)，3-10組(0.1016±0.0118)。根據(jù)SNK法分析結(jié)果，按a=0.05水準(zhǔn)，任兩組間的表達(dá)均有顯著性差異(P<0.05)。
　　 2.2 P450arom mRNA在建模后五個(gè)組的在位內(nèi)膜中的

10、表達(dá)
　　 方差分析結(jié)果顯示，建模后P450arom mRNA在各組小鼠的在位內(nèi)膜中均有表達(dá)，表達(dá)量按0-0組，3-0組，0-3組，3-3組，3-10組的順序依次增加，即0-0組(0.0902±0.0136)，3-0組(0.1695±0.0072)，0-3組(0.2367±0.0211)，3-3組(0.2986±0.0139)，3-10組(0.3644±0.0112)。且經(jīng)SNK法結(jié)果表明，P450arom mRNA在五個(gè)組在位

11、內(nèi)膜的表達(dá)中具有顯著性差異(P=-0.000)，任兩組間在位內(nèi)膜間P450arom mRNA的表達(dá)也均有顯著性差異(P<0.05)。
　　 2.3建模后，P450arom mRNA在各組小鼠異位內(nèi)膜中的表達(dá)
　　 2.3.1 P450arom mRNA在建模后五個(gè)組中皮下異位內(nèi)膜中的表達(dá)
　　 P450arom mRNA在小鼠皮下異位組織中均有表達(dá)。根據(jù)非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，P450arom mRNA在五個(gè)組異位內(nèi)

12、膜的表達(dá)中具有顯著性差異(P=0.000)，表達(dá)量按0-0組，3-0組，0-3組，3-3組，3-10組的順序依次增加，即0-0組(0.1168±0.0013)，3-0組(0.1980±0.0010)，0-3組(0.2806±0.0048)，3-3組(0.3873±0.0021)，3-10組(0.4817±0.0038)。根據(jù)兩個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，按a=0.05水準(zhǔn)，任兩組間異位內(nèi)膜間P450arom mRNA的表達(dá)均具有顯著

13、性差異(P<0.05)。
　　 2.3.2 P450arom mRNA在建模后五個(gè)組的腹膜異位內(nèi)膜中的表達(dá)
　　 P450arom mRNA在小鼠腹膜異位組織中均有表達(dá)。根據(jù)非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，P450arom mRNA在五個(gè)組在位內(nèi)膜的表達(dá)中具有顯著性差異(P=0.000)，表達(dá)量按0-0組，3-0組，0-3組，3-3組，3-10組的順序依次增加，即0-0組(0.1236±0.0009)，3-0組(0.2269±0.0

14、011)，0-3組(0.3390±0.0043)，3-3組(0.4345±0.0037)，3-10組(0.5009±0.0016)。根據(jù)多個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，按a=0.05水準(zhǔn)，任兩組間異位內(nèi)膜間P450arom mRNA的表達(dá)均具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 2.3.3 P450arom mRNA在建模后五個(gè)組中卵巢異位內(nèi)膜中的表達(dá)
　　 P450arom mRNA在五個(gè)組的卵巢異位內(nèi)膜中均有表達(dá)。

15、根據(jù)非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，P450arom mRNA在五個(gè)組中的表達(dá)具有顯著性差異(P=-0.000)，表達(dá)量按0-0組，3-0組，0-3組，3-3組，3-10組的順序依次增加，即0-0組(0.1240±0.0014)，3-0組(0.3277±0.0012)，0-3組(0.4507±0.0015)，3-3組(0.5646±0.0010)，3-10組(0.6355±0.0011)。根據(jù)多個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，按a=0.05水準(zhǔn)，任

16、兩組間異位內(nèi)膜間P450arom mRNA的表達(dá)均具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 3、P450 arom蛋白在建模前后五個(gè)組的在位和異位內(nèi)膜中的表達(dá)
　　 3.1 P450 arom蛋白在建模前五個(gè)組的在位內(nèi)膜中的表達(dá)
　　 建模前P450arom蛋白在0-0組中沒有表達(dá)，在其余四個(gè)組中均有表達(dá)。根據(jù)方差分析結(jié)果顯示，P450arom蛋白在四個(gè)組在位內(nèi)膜的表達(dá)中具有顯著性差異(P=-0.000)，表達(dá)量按

17、3-0組，0-3組，3-3組，3-10組的順序依次增加，即：3-0組(0.1464±0.0338)，0-3組(0.1756±0.0472)，3-3組(0.2345±0.0546)，3-10組(0.2794±0.0330)。根據(jù)SNK法結(jié)果顯示，按a=0.05水準(zhǔn)，任兩組間異位內(nèi)膜間P450arom mRNA的表達(dá)均具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 3.2 P450 arom蛋白在建模后五個(gè)組的在位內(nèi)膜中的表達(dá)
　　

18、 P450arom蛋白在建模后五個(gè)組小鼠的在位內(nèi)膜中均有表達(dá)。根據(jù)方差分析結(jié)果顯示，P450arom蛋白在五個(gè)組的表達(dá)中具有顯著性差異(P=-0.000)，表達(dá)量按0-0組，3-0組，0-3組，3-3組，3-10組的順序依次增加，即0-0組(0.2084±0.0215)，3-0組(0.2355±0.0248)，0-3組(0.2663±0.0309)，3-3組(0.2907±0.0353)，3-10組(0.3173±0.0270)。根據(jù)S

19、NK法結(jié)果顯示，按a=0.05水準(zhǔn)，任兩組間異位內(nèi)膜間P450arommRNA的表達(dá)均具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 3.3 P450 arom蛋白在建模后五個(gè)組的異位內(nèi)膜中的表達(dá)
　　 3.3.1 P450 arom蛋白在建模后五個(gè)組小鼠皮下異位內(nèi)膜中的表達(dá)
　　 P450 arom蛋白在五個(gè)組小鼠皮下異位灶中均有表達(dá)。根據(jù)非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，P450 arom蛋白在五個(gè)組中的表達(dá)具有顯著性差異(P=0

20、.000)，且表達(dá)量按0-0組，3-0組，0-3組，3-3組，3-10組的順序依次增加，即0-0組(0.2412±0.0136)，3-0組(0.2664±0.0223)，0-3組(0.2985±0.0333)，3-3組(0.3509±0.0014)，3-10組(0.4092±0.0017)。根據(jù)多個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，按a=0.05水準(zhǔn)，任意兩組間的表達(dá)均具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 3.3.2 P450 a

21、rom蛋白在建模后5個(gè)組腹膜異位內(nèi)膜中的表達(dá)
　　 P450 arom蛋白在五個(gè)組小鼠腹膜異位灶中均有表達(dá)。根據(jù)非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，P450 arom蛋白在五個(gè)組中的表達(dá)具有顯著性差異(P=0.000)，且表達(dá)量按0-0組，3-0組，0-3組，3-3組，3-10組的順序依次增加，即0-0組(0.2597±0.0014)，3-0組(0.2988±0.0190)，0-3組(0.3286±0.0220)，3-3組(0.4425±0.0

22、288)，3-10組(0.5202±0.0115)。根據(jù)多個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，按a=0.05水準(zhǔn)，任意兩組間的表達(dá)均具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 3.3.3 P450 arom蛋白在建模后5個(gè)組卵巢異位內(nèi)膜中的表達(dá)P450 arom蛋白在五個(gè)組小鼠卵巢異位灶中均有表達(dá)。根據(jù)非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，P450 arom蛋白在五個(gè)組中的表達(dá)具有顯著性差異(P=0.000)，且表達(dá)量按0-0組，3-0組，0-3組，3-

23、3組，3-10組的順序依次增加，即0-0組(0.2853±0.0219)，3-0組(0.3381±0.0347)，0-3組(0.4337±0.0514)，3-3組(0.5409±0.0551)，3-10組(0.6337±0.0293)。根據(jù)多個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，按a=0.05水準(zhǔn)，任意兩組間的表達(dá)均具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 4建模前后，P450arom mRNA和蛋白在增生期(動(dòng)情前期和動(dòng)情期)和分泌期

24、(動(dòng)情后期和動(dòng)情間期)中的表達(dá)不具有顯著性差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、小鼠模型中卵巢異位灶的成活率高于皮下異位灶和腹膜異位灶。
　　 2、一定劑量的TCDD促進(jìn)了小鼠模型中異位灶的成活。
　　 3、建模前，小鼠在位內(nèi)膜中P450arom的表達(dá)隨TCDD暴露劑量和暴露時(shí)間的增加而增加。說明TCDD可能通過增加在位子宮內(nèi)膜中P450arom的表達(dá)水平來增加EMs發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)。
　　

25、4、建模后，P450arom在小鼠在位內(nèi)膜中的表達(dá)隨TCDD暴露劑量和暴露時(shí)間的增加而增加，且表達(dá)量比建模前高。說明TCDD可能通過繼續(xù)增加在位內(nèi)膜中P450arom的表達(dá)水平進(jìn)一步惡化在位內(nèi)膜的環(huán)境，并可能促使新的內(nèi)異灶的發(fā)生。
　　 5、建模后，P450arom在皮下、腹膜和卵巢異位內(nèi)膜中的表達(dá)隨著TCDD暴露劑量和暴露時(shí)間的增加而增加。說明TCDD暴露通過促進(jìn)異位灶中P450arom的合成，加速EMs的發(fā)展。