小鼠Il-17A和Il-17AshRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及功能鑒定.pdf

1、第一部分小鼠IL-17A基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及功能鑒定
　　 目的:構(gòu)建小鼠IL-17A基因真核表達(dá)載體，在293T細(xì)胞中驗(yàn)證其表達(dá)IL-17A的能力。
　　 方法:根據(jù)Genbank中小鼠IL-17AmRNA序列(NM010552.3)設(shè)計(jì)PCR引物，兩端分別引入限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，提取小鼠脾臟組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，以此為模板進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，將目的基因亞克隆至T載體中，重組T載體經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定正確

2、后，雙酶切重組T載體，回收目的片段，在T4連接酶作用下定向克隆至真核質(zhì)粒載體pLVX-IRES-ZsGreen1中，構(gòu)建IL-17A基因真核表達(dá)載體LVX-IL-17A-IRES-ZsGreen1，進(jìn)行雙酶切及測(cè)序鑒定。表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，用Real-time PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染24h、48h后細(xì)胞IL-17AmRNA的表達(dá)量，用ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染24h、48h后細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17A表達(dá)量。
　　 結(jié)果:重組T載體及

3、真核表達(dá)載體雙酶切后電泳可見約500bp片段，與目的基因大小相符，測(cè)序結(jié)果與IL-17A基因進(jìn)行BLAST比對(duì)分析完全吻合。與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染24h、48h后細(xì)胞IL-17AmRNA表達(dá)水平均明顯增高，細(xì)胞上清中IL-17A表達(dá)水平均明顯增高。
　　 結(jié)論:本研究從小鼠脾臟組織中成功克隆了IL-17A基因，構(gòu)建了高表達(dá)小鼠IL-17A的真核表達(dá)質(zhì)粒，為今后研究IL-17A在腎小球疾病中的作用及分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

4、　　 第二部分小鼠IL-17AshRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及抑制IL-17A表達(dá)的有效序列篩選
　　 目的:構(gòu)建3個(gè)小鼠IL-17AshRNA表達(dá)質(zhì)粒，在293T細(xì)胞中驗(yàn)證其抑制IL-17A表達(dá)的能力并篩選出抑制效率最佳的序列。
　　 方法:根據(jù)GenBank中小鼠IL-17AmRNA序列(NM_010552.3)，利用Invitrogen公司網(wǎng)站在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)3條shRNA序列及1條陰性對(duì)照序列，兩端分別引入限制性內(nèi)切

5、酶酶切位點(diǎn)，合成Oligo DNA，退火形成雙鏈后，在T4 DNA連接酶作用下定向克隆至真核載體pLVX-shRNA中，獲得3個(gè)shRNA表達(dá)質(zhì)粒和1個(gè)陰性對(duì)照質(zhì)粒（shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNAC），并進(jìn)行測(cè)序鑒定。293T細(xì)胞分為空白對(duì)照組、shRNA1組、shRNA2組、shRNA3組、shRNAC組，各組分別進(jìn)行各干擾質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，用Real-time PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染24h、48h后細(xì)胞IL-17

6、AmRNA的表量達(dá)，用ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染24h、48h后細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17A表達(dá)量。
　　 結(jié)果:各shRNA表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與Oligo DNA完全一致;與shRNA C組相比，shRNA1、shRNA2、shRNA3組轉(zhuǎn)染后24h、48h細(xì)胞IL-17A基因mRNA水平顯著降低，shRNA1表達(dá)水平最低;細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17A表達(dá)水平與mRNA表達(dá)水平一致。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建3個(gè)小鼠IL