熱休克蛋白90介導(dǎo)的放射性分子探針對(duì)人非小細(xì)胞肺癌靶向治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：分子伴侶熱休克蛋白90（Heat shock protein90，HSP90）作為熱休克蛋白家族成員之一，在腫瘤細(xì)胞的存活過程中有非常重要的作用，是腫瘤治療的一個(gè)有效靶點(diǎn)。研究放射性131I標(biāo)記17-丙烯胺基-17-去甲氧基格爾德霉素（17-allylamino-17-demethoxygeldanamy-cin，17-AAG）在體內(nèi)、外生物活性分析，探討核素標(biāo)記HSP90抑制劑對(duì)人非小細(xì)胞肺癌靶向治療潛力。
　　 研

2、究方法：1.H460、A549、SPC-A-1三種非小細(xì)胞肺癌及EC-304正常人內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增后，間接細(xì)胞免疫熒光染色和western blot分析觀測(cè)三種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞上HSP90表達(dá)情況，以正常EC-304細(xì)胞作對(duì)照；加入不同濃度17-AAG（0、15、30、60、120 nM）干預(yù)細(xì)胞，計(jì)算存活細(xì)胞率和72h半數(shù)抑制率（IC50），比較不同細(xì)胞株對(duì)藥物的敏感性。2.雙氧水法制備131I（125I）-17-AAG，觀察放射性標(biāo)

3、記探針體外穩(wěn)定性和生物活性，放射性受體-配體飽和實(shí)驗(yàn)測(cè)定125I標(biāo)記17-AAG與不同細(xì)胞株結(jié)合的平衡解離常數(shù)（Kd）和最大結(jié)合位點(diǎn)容量（Bmax）；MTT法比較四種給藥方式對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，包括17-AAG（1μg）、Na131I（740kBq）、131I-17-AAG（185 kBq、370 kBq、740 kBq和1480kBq）、和17-AAG（1μg）+131I-17-AAG（740kBq）聯(lián)合給藥，并用流式細(xì)胞術(shù)分析對(duì)細(xì)胞

4、凋亡率和細(xì)胞周期變化的影響。3.荷H460非小細(xì)胞肺癌裸鼠皮下移植瘤模型建立。體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)：24只荷瘤鼠分間質(zhì)注射或尾靜脈注射131I-17-AAG（每只1.85MBq/0.1mL），分別于0.5h、4h、24h和1w處死，取血和主要組織臟器測(cè)放射性計(jì)數(shù)率值；體內(nèi)顯像實(shí)驗(yàn)：12只荷瘤鼠隨機(jī)分為4組（n=3），包括131I-17-AAG間質(zhì)給藥組、靜脈給藥組、Na131I間質(zhì)給藥對(duì)照組及競(jìng)爭(zhēng)性顯像組，放射性給藥劑量為每只5.55MBq，0

5、.1mL，并且競(jìng)爭(zhēng)性顯像組提前2h予未標(biāo)記17-AAG200μg，行SPECT顯像觀察；治療實(shí)驗(yàn)：28只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為7組（n=4），間質(zhì)和尾靜脈注藥各3組，劑量依序?yàn)?.5MBq×2、11.0MBq和5.5MBq，另設(shè)空白對(duì)照組。觀察16d后處死，做光鏡、電鏡及免疫組化檢測(cè)；Western blot檢測(cè)瘤體組織治療后HSP90及EGFR表達(dá)改變。
　　 研究結(jié)果：1.免疫熒光染色和western blot結(jié)果顯示三種非小細(xì)胞

6、肺癌H460、A549、SPC-A-1細(xì)胞均存在HSP90陽性表達(dá)，正常人內(nèi)皮細(xì)胞EC-304亦存在少量表達(dá)；17-AAG作用72h后對(duì)各肺癌細(xì)胞H460、A549、SPC-A-1半數(shù)抑制濃度依序?yàn)?8.01nM、23.14 nM和26.54nM，均遠(yuǎn)低于EC-304=的半數(shù)抑制濃度769.8nM。2.放射性標(biāo)記探針131I-17-AAG放射化學(xué)純度>96.51％，4℃放置，體外保持較好的穩(wěn)定性。標(biāo)記探針與H460細(xì)胞上HSP90受體靶

7、向結(jié)合特異性相對(duì)最高，為Kd=1.272nmol/L，而A549細(xì)胞膜上HSP90所需最大結(jié)合容量最多，為Bmax=0.086pmol/105個(gè)細(xì)胞，正常人內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合飽和曲線呈非特異性結(jié)合。131I-17-AAG組對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用較17-AAG組明顯（72h tH460=9.89，tA549=12.58和tSPC-A-1=10.84，均P<0.05）。17-AAG+131I-17-AAG聯(lián)合治療抑制效應(yīng)顯著，17-AAG具有一定的放

8、射增敏效應(yīng)。3.體內(nèi)顯像提示間質(zhì)注射131I-17-AAG瘤體內(nèi)放射性濃聚明顯并長(zhǎng)時(shí)間滯留，體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦予證實(shí)；尾靜脈給藥瘤體內(nèi)存在一定放射性攝取，藥物體內(nèi)清除較快；Na131I注射后迅速排出體外，無瘤內(nèi)滯留；競(jìng)爭(zhēng)性顯像示瘤內(nèi)攝取降低，標(biāo)記探針與瘤組織為特異性結(jié)合。形態(tài)學(xué)觀察顯示131I-17-AAG的治療抑瘤效應(yīng)最好，瘤組織破壞最明顯，優(yōu)于靜脈給藥組。免疫組化顯示間質(zhì)及尾靜脈注藥組HSP90、Ki-67、Bcl-2陽性率均較對(duì)照

9、組下降（統(tǒng)計(jì)值依次為HSP90 t間質(zhì)=19.09和t靜脈=6.10；Ki-67 t間質(zhì)=11.54和t靜脈=7.19；Bcl-2 t間質(zhì)=11.27和t靜脈=6.33，均P<0.05）；Western blot結(jié)果顯示隨抑瘤作用增加，HSP90和EGFR蛋白表達(dá)降低。
　　 研究結(jié)論：1.肺癌細(xì)胞對(duì)HSP90抑制劑17-AAG敏感性明顯高于正常細(xì)胞，HSP90可以作為非小細(xì)胞肺癌治療研究的有效靶點(diǎn)。2.放射性標(biāo)記探針131I-