線粒體轉(zhuǎn)錄因子A對肝外膽汁淤積肝細胞mtDNA氧化損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、一、研究背景與目的
　　 肝外膽汁淤積常由于一些惡性腫瘤、肝外膽管結(jié)石阻塞膽管或先天膽道閉鎖導致膽汁流出受阻，膽汁積聚肝內(nèi)，疏水性的膽汁酸引起肝細胞凋亡和壞死，最后可導致肝纖維化和肝硬化。對一些膽管阻塞時間長，黃疸程度深的患者，不僅手術耐受能力低，即使膽道梗阻解除了，術后肝功能仍然恢復慢，甚至出現(xiàn)肝功能進一步損害，造成臨床治療失敗。
　　 因此，膽汁淤積如何引起肝臟功能損害，一直是國內(nèi)外學者關注的熱點。氧化應激和線粒體功

2、能障礙涉及到慢性肝臟膽汁淤積的發(fā)病機制，線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)對氧化應激高度敏感，極易發(fā)生氧化損傷。一旦mtDNA損傷超過某個閾值，mtDNA通過其編碼的呼吸鏈亞基對氧化應激具有放大作用，這樣會加重線粒體的氧化損傷直至細胞死亡。線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)具有結(jié)合和纏繞mtDNA及解螺旋能力，對維持mtDNA空間構想，調(diào)節(jié)mtDNA的復制和轉(zhuǎn)錄及損傷修復具有重要作用。基于以上研究背景，本課題擬研究

3、肝外膽汁淤積患者肝損傷與肝mtDNA改變的關系，探討線粒體轉(zhuǎn)錄因子A在肝外膽汁淤積中的表達及其對肝細胞mtDNA的保護作用，從而達到保護和改善膽汁淤積患者肝功能的目的。
　　 二、材料與方法
　　 1.病例標本與細胞系：嚴格按照入組條件選擇12個梗阻性黃疸患者，其中胰腺癌6例，壺腹周圍癌4例，膽管癌2例。10個非梗阻性黃疸患者為對照組，其中胰腺癌4例，膽囊結(jié)石6例。兩組患者在年齡、性別上無統(tǒng)計學差異，所有病例排除病毒性肝

4、炎感染、肝自身免疫性疾病或代謝性疾??；未用過有肝臟毒性的藥物；有酒精肝患者也被排除。術中肝組織標本獲取過程一致，排除肝門阻斷對mtDNA的影響。切取的肝組織標本迅速浸泡于液氮罐中，并保存在-80℃冰箱中。人正常肝細胞株L02購于中國科學院上海細胞所。
　　 2.HE染色觀察病例標本肝臟組織病理變化；試劑盒檢測氧化損傷指標MDA、8-OHdG改變及線粒體功能指標ATP含量的變化；實時熒光定量PCR檢測mtDNA及mtDNA轉(zhuǎn)錄水平

5、mtRNA改變；免疫組織熒光檢測mtDNA氧化損傷指標8-OHdG的變化及mtDNA核樣結(jié)構(anti-DNA)的改變。
　　 3.甘氨酸鵝去氧膽酸(GCDCA)處理L02細胞模擬膽汁淤積體外模型，試劑盒檢測L02細胞線粒體氧化指標ROS、8-OHdG改變、細胞活性和線粒體膜電位、ATP含量的變化；實時熒光定量PCR檢測mtDNA及mtDNA轉(zhuǎn)錄水平mtRNA改變；免疫組織熒光檢測mtDNA氧化損傷指標8-OHdG的變化及mtD

6、NA核樣結(jié)構(PicoGreen)的改變。
　　 4.用實時熒光定量PCR和western-blot檢測肝外膽汁淤積患者及GCDCA處理L02細胞后TFAM mRNA和蛋白水平的變化。
　　 5.利用重組質(zhì)粒pEGFP-N1-TFAM、pEGFP-N1-△ C-TFAM及pEGFP-N1對照，過表達TFAM或△C-TFAM后，觀察其對GCDCA處理L02細胞mtDNA的拷貝數(shù)及轉(zhuǎn)錄水平mtRNA的影響；觀察過表達TFAM

7、或△C-TFAM后對肝細胞線粒體功能的改變；免疫組織熒光檢測mtDNA氧化損傷指標8-OHdG的變化及mtDNA核樣結(jié)構(PicoGreen)的改變。
　　 三、結(jié)果
　　 1.肝外膽汁淤積患者HE：肝索結(jié)構紊亂，肝細胞胞漿內(nèi)膽色素沉積，肝細胞輪廓不清，腫脹，變性壞死，可見空泡樣變；肝血竇擴張，膽小管擴張，內(nèi)見膽汁淤積，
　　 小葉內(nèi)見大量炎性細胞浸潤。與對照組相比，肝外膽汁淤積患者MDA升高4倍，ATP生成減少

8、37％，肝組織線粒體內(nèi)8-OHdG定量檢測升高9.9倍(p<0.01)。免疫熒光檢測膽汁淤積患者肝細胞mtDNA均發(fā)現(xiàn)有明顯的氧化損傷，而對照組未發(fā)現(xiàn)有氧化損傷。實時定量PCR顯示膽汁淤積患者肝組織mtDNA拷貝數(shù)較對照組下降了60％(p<0.01)，代表mtDNA編碼基因轉(zhuǎn)錄水平COX1，ND1和ND6均有明顯下降(p<0.05)，免疫熒光檢測肝外膽汁淤積患者mtDNA核樣結(jié)構明顯減少。
　　 2.GCDCA處理L02細胞后，

9、隨著GCDCA濃度增加，L02細胞線粒體氧化指標ROS含量、8-OHdG水平逐漸增加；肝細胞mtDNA拷貝數(shù)及轉(zhuǎn)錄水平mtRNA逐漸減少；線粒體功能(CCK-8、膜電位、ATP含量)下降。免疫細胞熒光顯示隨著GCDCA濃度增加肝細胞內(nèi)8-OHdG含量逐漸增加而mtDNA核樣結(jié)構逐漸減少。
　　 3.實時定量熒光PCR顯示肝外膽汁淤積患者TFAM mRNA表達較對照組明顯減少，在GCDCA(50，75，100μ M)處理L02細胞

10、6小時后TFAM mRNA表達較對照組分別下降了27％，32％和60％(p<0.05)；Western-blot結(jié)果顯示，肝外膽汁淤積患者TFAM蛋白表達較對照組明顯減少；與對照組相比，GCDCA250M處理L02細胞6小時后，TFAM蛋白表達無明顯變化，但隨著GCDCA濃度加大(50，75，100μM)，TFAM蛋白表達逐漸減少，100μ M時達最低。
　　 4.過表達TFAM后，GCDCA處理的L02細胞mtDNA拷貝數(shù)增加

11、及轉(zhuǎn)錄水平恢復，肝細胞活力和線粒體功能(膜電位、ATP含量)得到改善。免疫細胞熒光顯示肝細胞內(nèi)8-OHdG含量逐漸下降而mtDNA核樣結(jié)構逐漸增加。而過表達△C-TFAM，由于敲除了TFAM蛋白中具有轉(zhuǎn)錄活性的C末端，僅保留其維持mtDNA核樣結(jié)構和維持拷貝數(shù)的功能，故其對肝細胞線粒體功能的改善程度較野生型差。
　　 四、結(jié)論
　　 1.肝mtDNA氧化損傷參與了肝外膽汁淤積患者肝細胞功能損害。
　　 2.肝mt