氧化油脂對草魚肝細(xì)胞損傷機(jī)制的研究.pdf

1、試驗一草魚(Ctenopharyngodon idellus)肝細(xì)胞分離與原代培養(yǎng)
　　離體培養(yǎng)的肝細(xì)胞在短期內(nèi)形態(tài)和功能會發(fā)現(xiàn)顯著變化,為探討其在這變化期間的最佳功能狀態(tài),在不同條件下進(jìn)行原代培養(yǎng),以探討適合草魚肝細(xì)胞生長的最佳條件及培養(yǎng)方法,用于飼料營養(yǎng)與非營養(yǎng)物質(zhì)對草魚肝細(xì)胞代謝、損傷作用機(jī)制的研究。采用改進(jìn)的胰蛋白酶消化法和紅細(xì)胞裂解液分離、純化肝細(xì)胞,置于已配置好的M199培養(yǎng)基中進(jìn)行原代培養(yǎng)。通過顯微鏡計數(shù)法和臺盼藍(lán)排

2、斥法計算細(xì)胞產(chǎn)量和存活率;MTT比色法連續(xù)測試培養(yǎng)6d肝細(xì)胞的活力;熒光顯微鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,并收集不同時期培養(yǎng)液上清,檢測肝細(xì)胞白蛋白分泌、尿素合成功能和LDH釋放量。結(jié)果顯示采用0.25％濃度的溫胰蛋白酶消化法,消化20min,分步收集肝細(xì)胞,經(jīng)臺盼藍(lán)染色檢測和血球計數(shù)板計數(shù),活細(xì)胞數(shù)≥99%。在含10%胎牛血清、10μg/mL胰島素的M199培養(yǎng)基中,以接種濃度1.7×106 c ell/mL左右為宜,置于27℃、4.5%C

3、O2濃度的恒溫培養(yǎng)箱中可成功培養(yǎng)草魚原代肝細(xì)胞。MTT實驗結(jié)果顯示在培養(yǎng)第2d時A值最高,細(xì)胞處于最佳狀態(tài)。熒光纖維鏡下可見肝細(xì)胞成多邊形生長,細(xì)胞周圍有大量偽足伸出,使其貼壁更加牢固,細(xì)胞間隔清晰可見,高倍鏡下可見圓形細(xì)胞核。細(xì)胞可生長10d以上。肝功能檢測結(jié)果顯示24~72h階段細(xì)胞增殖能力強(qiáng),LDH含量顯著性降低(P<0.05),BUN含量明顯增加(P<0.05),白蛋白含量呈上升趨勢。此階段肝細(xì)胞生長狀態(tài)最好,適合用于肝細(xì)胞代謝

4、、損傷及基因表達(dá)的研究。
　　試驗二氧化豆油水溶物對草魚肝細(xì)胞損傷作用的研究
　　本研究以草魚原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞為試驗材料,研究不同濃度和不同作用時間氧化豆油水溶物對草魚肝細(xì)胞的毒理影響。通過測定培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量,采用油紅 O和堿性磷酸酶染色以及透射電鏡等方法檢測和觀察肝細(xì)胞的生長變化。結(jié)果顯示高濃度(0.22656、0.15104g)組氧化豆油水溶物作用3h就可導(dǎo)

5、致草魚肝細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,LDH釋放量增加,T-AOC能力提高,MDA含量較高。草魚肝細(xì)胞的損傷程度與水溶液的作用濃度和時間存在顯著性關(guān)系,高濃度組與對照組相比損傷嚴(yán)重,隨著時間的延長肝細(xì)胞加劇凋亡。
　　試驗三氧化豆油水溶物對草魚原代肝細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)活性的影響
　　以原代培養(yǎng)24h的草魚肝細(xì)胞為研究對象,添加0.22656g氧化豆油所含水溶物,分別作用1、1.5、2、2.5和3h,收集草魚肝細(xì)胞樣品,探討氧化豆油水溶

6、物對肝細(xì)胞的損傷作用。采用實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)方法,檢測草魚肝細(xì)胞 IGF、PPAR-α、PPAR-γ、FAS、PGC1-α、SCD1、UCP2的mRNA表達(dá)量。各試驗組的IGF-Ⅰ、UCP2、PGC1-α、PPAR-α基因表達(dá)量與對照組相比,均呈現(xiàn)顯著性下調(diào)(P<0.05); FAS、SCD1、PPAR-γ的基因表達(dá)量與對照組相比,均呈現(xiàn)顯著性上調(diào)(P<0.05);且各基因試驗組中2.5、3h各基因表達(dá)量與1h相比