幾種重要外源因子對草魚肝細胞活力、抗氧化、凋亡和熱應激蛋白表達的影響.pdf

1、草魚（Ctenopharyngodon idellus）又稱白鯇、草根魚、厚魚，有生長快速、產量高和養(yǎng)殖成本低的特點，是中國重要的淡水養(yǎng)殖品種。2011年中國草魚總產量達到454萬噸，居世界首位(FAO，2012)，具有極好的經(jīng)濟價值。草魚已經(jīng)被東亞，北美和歐洲超過100個國家引進。目前在中國和世界其他地區(qū)，草魚在養(yǎng)殖過程中面臨病害頻發(fā)和藥物濫用問題，特別是高溫下，魚類病害進一步加劇。這不利于草魚養(yǎng)殖產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本論文針對養(yǎng)殖過程

2、中的高溫脅迫因子，以草魚肝細胞為研究對象，開展不同溫度應激及其恢復對草魚肝臟細胞氧化損傷和熱應激蛋白表這影響研究，探索大黃素和恩諾沙星對草魚肝臟細胞毒性、氧化損傷、凋亡和熱應激蛋白（HSP60、70和90）相對mRNA表達的影響。分析了高溫預處理和低濃度大黃素對草魚肝細胞抗高溫應激的保護作用，為探討大黃素的應激調控機理提供依據(jù)。
　　1.不同高溫應激和恢復對草魚肝細胞活力、氧化損傷和熱應激蛋白表達的影響本試驗是為了研究不同高溫應激

3、和恢復對草魚肝細胞活力、乳酸脫氫酶(LDH)釋放、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)產物、總抗氧化能力(T-AOC)、熱應激蛋白（HSP60、70和90）相對mRNA表達的影響。首先將培養(yǎng)的草魚肝細胞分別在高溫30℃、32℃和34℃條件下暴露0.5 h，然后將各組細胞立即放回27℃恢復6h、12h、24 h和48h。結果表明高溫顯著降低細胞活力，增加了LDH釋放?；謴秃蠹毎麚p傷減少。高溫應激增加了MDA水平，降低了抗氧化能力

4、（降低了細胞的SOD活性和T-AOC）。然而，氧化損傷隨著恢復時間增加而下降，MDA、SOD活性和T-AOC有所恢復。當細胞暴露于32℃，HSP60 mRNA的表達在恢復6h和24 h高于對照組(P＜0.05)，HSP70mRNA的表達在恢復6h、24 h和48 h高于對照組(P＜0.05)，HSP90mRNA的表達在恢復6h和24 h高于對照組（P＜0.05）?；謴瓦^程中，HSPs基因表達的變化反映了細胞從生長狀態(tài)過渡到細胞修復狀態(tài)。

5、總之，高溫抑制細胞活力，引起氧化損傷，并增加HSPs表達，而HSPs在草魚肝細胞的熱應激中有重要作用。
　　2.高溫應激不同時間對草魚肝細胞活力、氧化損傷和熱應激蛋白表達的影響
　　本試驗的研究目的是探討高溫應激不同時間對草魚肝細胞活力、LDH釋放、SOD活性、MDA產物、T-AOC和HSPs（HSP60、70和90）相對mRNA表達的影響。把培養(yǎng)的細胞在高溫(32℃)下分別暴露0.5、1、2、4、8 h。結果表明，高溫應激

6、顯著降低細胞活力(P＜0.01)，增加0.5 h和1h處理組的LDH釋放(P＜0.05)。此外，0.5和8h高溫處理組的T-AOC明顯降低(P＜0.05)，1h高溫處理組的SOD活性明顯降低(P＜0.05)，8h處理組MDA產物顯著增加(P＜0.05)，表明高溫引起氧化應激。這可能一定程度解釋了此時細胞活力的減少和LDH釋放的增加。SOD活性、MDA產物和T-AOC在高溫應激2h和對照組之間的差距最小。這表明，細胞能誘導抗氧化酶系統(tǒng)對抗

7、氧化應激。進一步的試驗表明，HSP60 mRNA在應激1、2和4h(P＜0.05)，HSP70 mRNA在應激0.5和1h（P＜0.01），和HSP90mRNA在所有應激時間點的mRNA表達都顯著增加（P＜0.01）。這表明HSPs有能力調節(jié)細胞抗應激反應，對保護生物熱應激有重要作用?？傊?，高溫抑制草魚肝細胞增殖，誘導細胞氧化應激，提高HSPs表達。
　　3.大黃素和恩諾沙星對草魚肝細胞活力、抗氧化能力、凋亡和熱應激蛋白表達的影響

8、
　　本試驗是為了探討不同濃度大黃素和恩諾沙星對草魚肝細胞活力、LDH釋放、SOD活性、谷胱甘肽(GSH)、T-AOC、MDA產物、活性氧(ROS)、細胞膜電位（ΔΨm）、凋亡和HSPs（HSP60、70和90）相對mRNA表達的影響。把培養(yǎng)的細胞用不同濃度大黃素(0.04-25μg·mL-1)和恩諾沙星(12.5-200μg·mL-1)處理24 h。結果表明，大黃素（1-25μg·mL-1）增加LDH釋放(P＜0.05)，其誘導

9、的細胞凋亡伴隨著ΔΨm的下降和ROS的升高;大黃素處理組SOD活性和T-AOC顯著降低表明大黃素誘導氧化應激導致失去其清除自由基的酶的活性，而GSH的升高表明細胞嘗試去維持氧化還原平衡，但是不足以補償大黃素誘導的氧化應激。同時大黃素誘導HSP60、70和90 mRNA表達上升，說明大黃素可以產生保護作用。而用恩諾沙星處理細胞表明，恩諾沙星(50-200μg·mL-1)也顯著降低細胞活力增加LDH釋放(P＜0.05)，誘導細胞凋亡和膜電位

10、下降(P＜0.05)，恩諾沙星顯著升高ROS和MDA產物，降低T-AOC（P＜0.05）表明恩諾沙星引發(fā)脂質過氧化作用，破壞氧化平衡。HSP60和HSP70mRNA在低濃度的恩諾沙星作用下先升高，后下降，而HSP90mRNA的表達持續(xù)下降說明高濃度恩諾沙星導致細胞的病理性損傷或蛋白合成受到抑制。
　　4.不同高溫預處理對大黃素處理草魚肝細胞的影響
　　本試驗是為了研究不同高溫預處理對大黃素處理的草魚肝細胞活力、LDH釋放、S

11、OD活性、T-AOC、ROS、ΔΨm和HSPs（HSP60、70和90）相對mRNA表達的影響。把培養(yǎng)的細胞在高溫30℃、32℃和34℃暴露0.5 h，然后立即放回27℃恢復12 h，接著把細胞用不同濃度大黃素（0.04-25μg·mL-1）處理24 h。試驗結果顯示，30℃預處理組顯著增加高濃度大黃素組(1、5、25μg· mL-1)細胞活力（P＜0.05），降低LDH釋放(P＜0.05)，提高細胞膜電位（P＜0.05），說明30℃高

12、溫預處理可以減輕大黃素對細胞產生的損傷;30℃高溫預處理組的ROS最低，和大黃素對照組之間差異顯著（P＜0.05），這表明草魚肝細胞在大黃素處理后，機體正在經(jīng)歷氧化應激誘導的損傷，細胞有可能引起生理功能紊亂甚至喪失;30℃高溫預處理組SOD活性和T-AOC顯著增加(P＜0.05)，說明30℃溫和高溫預處理使細胞產生抗氧化酶而保護其不受ROS的損傷;3種高溫預處理（30℃、32℃和34℃）都能顯著增加HSPs的表達(P＜0.05)，由此推

13、斷出高溫預處理使得草魚肝細胞預先誘導產生的HSPs會保護氧自由基，抑制細胞凋亡，對高濃度大黃素產生的細胞損傷產生保護作用。
　　5.不同濃度大黃素對高溫應激草魚肝細胞的影響
　　本試驗是為了研究不同濃度大黃素對高溫應激草魚肝細胞活力、LDH釋放、SOD活性、T-AOC、ROS、ΔΨm和HSPs（HSP60、70和90）相對mRNA表達的影響。把培養(yǎng)的細胞用不同濃度大黃素處理（0.04-1μg·mL-1）處理24 h，然后讓細

14、胞在高溫32℃應激0.5 h。結果發(fā)現(xiàn)0.04μg·mL-1大黃素濃度組細胞活力顯著高于高溫應激組(P＜0.05)，LDH釋放顯著低于高溫應激組(P＜0.05)，說明0.04μg·mL-1大黃素對高溫應激細胞有保護作用。而其他大黃素處理組和高溫應激組差異不顯著，說明大黃素的保護作用并沒有劑量效應，0.04μg·mL1大黃素濃度組SOD活性高于高溫應激組(P＜0.05)，ROS含量低于高溫應激組，說明大黃素可有效地提高細胞SOD抗氧化酶的