黛礬散對(duì)雌激素誘導(dǎo)肝內(nèi)膽汁淤積大鼠肝細(xì)胞膜影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的肝內(nèi)膽汁淤積(intrahapticcholistasis，IC)是許多肝病的共有的基礎(chǔ)病變，其病因包括感染、藥物、妊娠、酒精、自身免疫、手術(shù)、遺傳等多種因素。近年來，隨著口服避孕藥及雌激素替代療法的應(yīng)用，雌激素誘導(dǎo)的肝內(nèi)膽汁淤積發(fā)病率有增高的趨勢(shì)。國(guó)外對(duì)肝內(nèi)膽汁淤積癥發(fā)病機(jī)制的研究已深入分子水平，但在治療方面，除最近推崇的膽石溶石藥熊去氧膽酸(UDCA)外，尚缺乏有效的治療藥物。我國(guó)有關(guān)肝內(nèi)膽汁淤積的研究正處于起步階段，西藥研究滯

2、后，而中藥治療已初見成效，并顯現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)和特色。但有關(guān)中藥治療方面的研究多為臨床研究，且多限于改善癥狀的觀察，缺乏確切的科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。臨床觀察證實(shí)，黛礬散對(duì)病毒性肝炎、膽道疾患、妊娠等引起的膽汁淤積有較好療效，但缺乏實(shí)驗(yàn)印證?；谏鲜鰢?guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀，我們以苯甲酸雌二醇(EB)誘導(dǎo)的肝內(nèi)膽汁淤積模型為基礎(chǔ)，用拆方研究方法，觀察中藥黛礬散對(duì)肝內(nèi)膽汁淤積模型大鼠肝功能、肝組織學(xué)及肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化、肝細(xì)胞膜流動(dòng)性、肝勻漿及肝竇膜中Na+-

3、K+-ATPase、Mg++-ATPase活性的影響，探討黛礬散治療肝內(nèi)膽汁淤的藥物作用靶點(diǎn)和可能作用機(jī)制，從而為中醫(yī)藥治療肝內(nèi)膽汁淤積癥提供科學(xué)依據(jù)，為尋求治療肝內(nèi)膽汁淤積的有效藥物研究打下基礎(chǔ)。 方法1、雄性Wistar大白鼠30只，體重280-320g，隨機(jī)分為5組，每組6只，分別為正常組(A)、模型組(B)、明礬組(C)、青黛組(D)及黛礬散組(E)。B、C、D、E等四組分別以EB橄欖油皮下注射(11mg/kg.d)，連

4、續(xù)3d進(jìn)行造成肝內(nèi)膽汁淤積模型。 2、觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小便顏色、毛色、飲食量和活動(dòng)情況；取各組大鼠肝臟，用4％甲醛常規(guī)固定，制成石臘切片，進(jìn)行HE常規(guī)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟取肝組織學(xué)變化；超薄切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛雙重染色，透視電子顯微鏡觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。 3、分離血清，常規(guī)生化檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)大鼠血清總膽汁酸(TBA)、總膽紅素(TBiL)、ALT、ALP、總膽固醇(Tch)的變化。 4、采用DPH

5、熒光探針技術(shù)，用熒光偏振度測(cè)定及微黏度的計(jì)算的方法，測(cè)定肝細(xì)胞亞膜(竇膜和毛細(xì)膽管膜)流動(dòng)性的變化。 5、取肝組織進(jìn)行勻漿，分離毛細(xì)膽管膜和肝細(xì)胞竇膜，分別檢測(cè)肝勻漿和毛細(xì)膽管膜中ALP水平，檢測(cè)肝勻漿及肝竇膜中Na+-K+-ATPase、Mg++-ATPase活性。 結(jié)果1、一般觀察可見，經(jīng)EB皮下注射，模型組動(dòng)物小便污染的白色草紙顏色黃染，黃色明顯較正常對(duì)照組為深。飲食量和活動(dòng)明顯減少，毛色欠光澤。其他組草紙顏色亦較

6、正常對(duì)照組為深，但較模型組對(duì)為淺；肉眼觀察可見，模型組肝臟腫脹，包膜緊張，邊緣鈍厚，色澤暗紅，有的呈顆粒狀；光鏡下觀察，肝細(xì)胞腫脹，空泡樣變性，部分肝細(xì)胞水腫，細(xì)胞質(zhì)疏松，尤以肝小葉周圍帶更為明顯，少有點(diǎn)狀肝細(xì)胞壞死，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝血竇變窄。除青黛組有1只大鼠肝細(xì)胞仍有輕度腫脹外，明礬組、青黛組及黛礬散組病理改變已基本恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)；電鏡下觀察，模型組肝細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)分布異常，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，并呈不同程度擴(kuò)張，線粒體腫脹，嵴斷裂或

7、消失，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，少數(shù)出現(xiàn)膜退形性變，雙核及多核的枯否氏細(xì)胞增多。部分毛細(xì)膽管擴(kuò)張，擴(kuò)張的毛細(xì)膽管中見微絨毛變短排列紊亂，膽小管內(nèi)見電子密度高的無定形物，可能為膽汁淤積。明礬組、青黛組及黛礬散組除少數(shù)大鼠肝細(xì)胞仍有輕度腫脹，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張、支架塌陷外，大部分大鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)均基本恢復(fù)正常。 2、肝功能檢測(cè)：模型組動(dòng)物血清總膽汁酸(TBA)、總膽紅素(TBiL)、及ALT、ALP均有明顯升高(P＜0.05)，總膽固醇(Tc

8、h)明顯下降(P＜0.05)；黛礬散組和明礬組TBA、TBiL、ALT及ALP明顯下降，Tch回升，與模型組比較差異顯著(P＜0.05)；青黛組在Tch上升、ALP下降，與模型組比較差異顯著(P＜0.05)。 3、細(xì)胞膜流動(dòng)性測(cè)定：模型組動(dòng)物肝細(xì)胞竇膜和毛細(xì)膽管膜的微黏度(η)明顯增高，與正常對(duì)照組比較，差異有顯著意義(P＜0.05)。與之相對(duì)應(yīng)的F值明顯降低，即膜流動(dòng)性明顯降低。而經(jīng)口投予黛礬散及其組分明礬和青黛處理后，肝細(xì)胞

9、竇膜和毛細(xì)膽管膜微黏度明顯降低，其中以黛礬散組降低最為顯著，明礬組次之，青黛組下降幅度最小，與模型組比較，差別均有顯著意義(P＜0.05)，相對(duì)應(yīng)的F值則明顯升高。 4、肝細(xì)胞膜系統(tǒng)ALP、Na+-K+-ATPase和Mg++-ATPase檢測(cè)：模型組大鼠肝勻漿及竇膜中，ALP活性水平較正常組均明顯升高(P＜0.05)，而竇膜中ALP的水平又顯著高于肝勻漿；在肝勻漿中，明礬組和黛礬散組ALP明顯低于模型組(P＜0.05)；在毛細(xì)

10、膽管膽中，明礬組、青黛組和黛礬散組ALP均明顯低于模型組(P＜0.05)。模型組大鼠肝勻漿及竇膜中，Na+-K+-ATPase和Mg++-ATPase活性水平較正常組均明顯減低(P＜0.05)，竇膜中兩酶的水平又顯著高于肝勻漿；在肝勻漿中，明礬組和青黛組Na+-K+-ATPase水平明顯高于模型組(P＜0.05)；而在竇膜中明礬組、青黛組和黛礬散組均明顯高于模型組(P＜0.05)；在肝勻漿及竇膜中，明礬組、青黛組和黛礬散組Mg++-AT

11、Pase活性均明顯高于模型組(P＜0.05)。 結(jié)論上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：雌激素苯甲酸雌二醇(EB)，引起肝損傷、肝功能損害，肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化、肝細(xì)胞膜流動(dòng)性的降低，導(dǎo)致膜上各種轉(zhuǎn)運(yùn)載體如Na+-K+-ATP、Mg++-ATP酶的活性下降，從而使細(xì)胞分泌膽汁障礙，影響毛細(xì)膽管膽汁流和膽鹽分泌速率，并最終形成肝內(nèi)膽汁淤積癥。這可能是雌激素導(dǎo)致肝內(nèi)膽汁淤積的發(fā)病學(xué)機(jī)制之一。 同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：經(jīng)口給予黛礬散及其組份明礬和青

12、黛，可對(duì)抗EB引起的肝損傷、肝功能損害，肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化、肝細(xì)胞膜流動(dòng)性的降低和Na+-K+-ATP、Mg++-ATP酶的活性下降，對(duì)雌激素導(dǎo)致的肝內(nèi)膽汁淤積具有明確的防治作用，且明礬和青黛有協(xié)同作用，而明礬的作用又優(yōu)于青黛。依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合雌激素性肝內(nèi)膽汁淤積發(fā)病機(jī)制，可以認(rèn)為，中藥黛礬散治療肝內(nèi)膽汁淤積癥的作用機(jī)理可能是通過以下途徑實(shí)現(xiàn)的：①減輕肝組織病變損傷，維持肝細(xì)胞正常的超微結(jié)構(gòu)和功能；②維護(hù)肝細(xì)胞膜的流動(dòng)性；③增強(qiáng)