HPV18 E2蛋白與hDaxx在細胞內(nèi)的共定位及對凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　分析人乳頭瘤病毒18型（HPV18）E2蛋白與hDaxx在細胞內(nèi)的分布與共定位，并初步研究兩種蛋白質(zhì)對凋亡的影響，為進一步探索E2蛋白在HPV18致癌機制中的作用以及E2防治性疫苗的研制提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　?。?）將質(zhì)粒pEGFP-C1/E2和pDsRed-Monomer-C1分別用EcoRI與BamHⅠ雙酶切，前者回收小片段約1000bp酶切產(chǎn)物，后者回收酶切產(chǎn)物，T4連接酶連接后，轉(zhuǎn)化E.co

2、li JM109，篩選陽性克隆，構(gòu)建 Red-HPV18 E2融合蛋白表達載體pDsRed-Monomer-C1/E2。
　?。?）將質(zhì)粒pDsRed-Monomer-C1/E2轉(zhuǎn)染 HeLa細胞，利用倒置熒光顯微鏡觀察 HPV18 E2蛋白在真核細胞中的表達與定位，并通過Western-blot進一步檢測其表達。
　?。?）將質(zhì)粒pDsRed-Monomer-C1/E2與pEGFP-C1/hDaxx共同轉(zhuǎn)染HeLa細胞，利

3、用激光共聚焦顯微鏡觀察HPV18 E2蛋白與hDaxx的分布，并分析它們的共定位。
　?。?）將0.5μg與1.0μg pcDNA3.1(-)/hDaxx質(zhì)粒分別和2.0μg pcDNA3.1(-)/E2質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染HeLa細胞，設(shè)pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染組和空細胞組作為對照。48h后，分別收集各組細胞，經(jīng)75％乙醇4℃固定過夜，PI染色后，用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。
　?。?）將0.5μg與1.0μg pcDNA

4、3.1(-)/hDaxx質(zhì)粒分別和2.0μg pcDNA3.1(-)/E2質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染HeLa細胞，設(shè)pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染組和空細胞組作為對照，培養(yǎng)48h后，分別收集各組細胞，按Caspase-8試劑盒說明書操作，用酶標儀測定405nm波長下的吸光度(A值)，計算Caspase-8的相對活性。
　　結(jié)果：
　　（1）重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，得到目的小片段約1100bp，測序分析所克隆的目的片段與 GenBank上公布的

5、HPV18 E2（NC_001562）基因序列一致，即構(gòu)建了pDsRed-Monomer-C1/E2重組體。
　?。?）真核表達載體pDsRed-Monomer-C1/E2能在HeLa細胞內(nèi)表達DsRed-HPV18 E2融合蛋白，且主要分布于細胞漿與細胞核。
　?。?）質(zhì)粒pEGFP-C1/hDaxx轉(zhuǎn)染的細胞，hDaxx定位細胞核；質(zhì)粒pEGFP-C1/hDaxx和pDsRed-Monomer-C1/E2共轉(zhuǎn)染細胞，hD

6、axx在細胞漿與細胞核均有，且綠色與紅色熒光重疊為黃色熒光，即HPV18 E2蛋白與hDaxx發(fā)生共定位。
　?。?）2μg pcDNA3.1(-)/E2+1.0μg pcDNA3.1(-)/hDaxx組凋亡率明顯高于2μg pcDNA3.1(-)/E2+0.5μg pcDNA3.1(-)/hDaxx組，差異具有顯著性（P＜0.001）；且兩組凋亡率都顯著高于其他組，差異具有顯著性（P＜0.001）。pcDNA3.1(-)/E2組

7、凋亡率明顯高于pcDNA3.1(-)組及空細胞組，差異具有顯著性（P＜0.001）。
　?。?）2μg pcDNA3.1(-)/E2+1.0μg pcDNA3.1(-)/hDaxx組Caspase-8的相對活性高于2μg pcDNA3.1(-)/E2+0.5μg pcDNA3.1(-)/hDaxx組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；且兩組凋亡率都顯著高于其他組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。pcDNA3.1(-)/E2組Ca

8、spase-8的相對活性高于pcDNA3.1(-)/ hDaxx、pcDNA3.1(-)組及空細胞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　?。?）構(gòu)建的pDsRed-Monomer-C1/E2真核表達載體能在HeLa細胞表達DsRed-HPV18 E2融合蛋白。
　?。?）HPV18 E2蛋白與hDaxx共定位細胞漿與細胞核，且E2蛋白使部分hDaxx從細胞核轉(zhuǎn)位至細胞漿。
　?。?）HPV18 E