LMP-3基因轉(zhuǎn)移對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及其用于治療骨缺損的研究.pdf

1、目的：創(chuàng)傷、疾病所造成的骨缺損是骨科治療的難題之一，隨著DNA重組技術(shù)及基因轉(zhuǎn)移技術(shù)、組織工程技術(shù)的進(jìn)展，骨缺損的治療得到了迅速發(fā)展。LMP是最近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)骨生成誘導(dǎo)蛋白，其中LMP-1和LMP-3具有成骨作用，是成骨細(xì)胞分化的正調(diào)節(jié)因子，可以促進(jìn)多種骨誘導(dǎo)因子的分泌，促進(jìn)骨鈣素的分泌和骨結(jié)節(jié)的形成，主要在骨的礦化過程中發(fā)揮重要作用。本研究借助組織工程技術(shù)，構(gòu)建LMP-3真核表達(dá)質(zhì)粒，研究其對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表型變化的影響，以明膠海綿為

2、支架，體內(nèi)研究其成骨作用，探討其對(duì)骨缺損的修復(fù)作用。 方法：應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增LMP-3的功能區(qū)序列，亞克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1，最終構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-LMP-3，同時(shí)進(jìn)行酶切簽定和測(cè)序；培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察LMP-3對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表型變化的影響，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-LMP-3，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)骨生長(zhǎng)標(biāo)志基因LMP-3、OCN、Type Collagen I、ALP、Bsp的表達(dá)

3、，生化檢測(cè)堿性磷酸酶的活性，放免法檢測(cè)骨鈣素的表達(dá)，以茜素紅染色法觀察礦化結(jié)節(jié)的形成情況，應(yīng)用免疫組化的方法檢測(cè)Type Collagen I的表達(dá)；制做兔橈骨缺損的動(dòng)物模型，以明膠海綿為支架，復(fù)合轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-LMP-3的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，移植至骨缺損部位，以x線觀察骨缺損的愈合情況，以HE染色觀察組織的生長(zhǎng)狀態(tài)、成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的分布。 結(jié)果：1、PCR擴(kuò)增LMP-3基因序列正確，構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N

4、1-LMP-3經(jīng)EcoRl和Hind3雙酶切測(cè)序鑒定正確。2、兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以成功培養(yǎng)，經(jīng)pEGFP-N1-LMP-3轉(zhuǎn)染后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以表達(dá)成骨生長(zhǎng)標(biāo)志基因OCN、Type Collagen I、ALP、Bsp，生化檢測(cè)到ALP的表達(dá)，礦化結(jié)節(jié)染色陽性，放免法檢測(cè)到了OCN的表達(dá)，免疫組化發(fā)現(xiàn)聊Type Collagen I的表達(dá)明顯增強(qiáng)；而對(duì)照組除Type Collagen I有輕度表達(dá)外，其余皆為陰性結(jié)果。3、成功建

5、立了免橈骨缺損的動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)組X線和組織學(xué)觀察皆證實(shí)了骨缺損的修復(fù)，實(shí)現(xiàn)了骨性連接，但明膠海綿移植組和單純細(xì)胞移植組沒有見骨缺損的愈合，骨斷端間為纖維組織連接。 結(jié)論：成功獲得真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEGFP-N1-LMP-3，為進(jìn)一步研究其成骨功能奠定了基礎(chǔ)；轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-LMP-3后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以分泌成骨生長(zhǎng)標(biāo)志基因，LMP-3功能區(qū)可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換，LMP-3功能區(qū)同其全長(zhǎng)cDNA一