Daam1在肺癌中表達(dá)的研究.pdf

1、目的: Daam1是蓬亂蛋白相關(guān)形態(tài)形成活化因子1或稱形態(tài)發(fā)生紊亂關(guān)聯(lián)激活因子1，為形成素蛋白家族的成員。Daam1是WNT/PCP通路的組成因子之一，此通路參與原腸胚形成以及細(xì)胞骨架重排等生理過(guò)程，在胚胎癌細(xì)胞系F9中，Kristi LaMonica等人觀察了壁層內(nèi)胚層的遷移并證明了PCP通路通過(guò)Rho/ROCK調(diào)控內(nèi)胚層細(xì)胞的遷移。抑制PCP通路中的Daam1的表達(dá)不但能夠引起遷移細(xì)胞數(shù)量增加，也能導(dǎo)致細(xì)胞定向障礙。有活性的

2、的Daam1能夠抑制細(xì)胞的定向障礙。目前，關(guān)于Daam1在肺癌組織中的表達(dá)與腫瘤的惡性程度，組織學(xué)分型及侵襲轉(zhuǎn)移能力之間的關(guān)系均不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)肺腺癌、肺鱗癌及癌旁組織中的的Daaml的表達(dá)情況，分析其與臨床病理因素的關(guān)系，探討Daam1在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。并通過(guò)檢測(cè)不同侵襲能力肺癌細(xì)胞系的Daam1表達(dá)水平，研究它們與組織學(xué)分型的關(guān)系，進(jìn)一步驗(yàn)證Daam1在肺癌中的表達(dá)及與肺癌組織學(xué)類型的關(guān)系。 材料與方法:

3、 1、Western Blot 39例新鮮肺癌及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，均取自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2007年—2008年間行外科手術(shù)切除的肺癌患者標(biāo)本。人肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞系BE1(高侵襲能力亞型)、LH7(低侵襲能力亞型)、人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，人肺腺癌細(xì)胞系SPC、人肺腺癌細(xì)胞系LTE及人支氣管上皮細(xì)胞系HBE，為本實(shí)驗(yàn)室凍存。提取組織與細(xì)胞的蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白，進(jìn)行SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉(zhuǎn)印，一抗

4、(anti—Daam11：200稀釋，anti-β—actin1：500稀釋)和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(1：2000稀釋)孵育，ECL發(fā)光。以β—actin為內(nèi)對(duì)照，結(jié)果判定為PVDF膜上出現(xiàn)灰色條帶，并對(duì)條帶進(jìn)行灰度值測(cè)定。 2. RT-PCR 37例新鮮肺鱗癌，腺癌，及相應(yīng)癌旁組織取自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2007年—2008年間手術(shù)切除的標(biāo)本。人肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞系BE1(高侵襲能力亞型)、LH7(低侵襲能力亞型)、人肺

5、腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，人肺腺癌細(xì)胞系SPC、人肺腺癌細(xì)胞系LTE及人支氣管上皮細(xì)胞系HBE，為本實(shí)驗(yàn)室凍存。提取組織與細(xì)胞的mRNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度，并用RNAnase free H20將RNA濃度稀釋成500ng/ul后，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，測(cè)量并調(diào)節(jié)cDNA濃度，進(jìn)行PCR，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)溴化乙啶(EB)染色，凝膠成像系統(tǒng)(BioImageing System，UVP，CA)下觀察。以β—actin為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算D

6、aam1的相對(duì)平均表達(dá)量。 3、統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1、Daam1在肺癌和癌旁肺組織中的表達(dá) 對(duì)39例新鮮肺鱗癌、腺癌和癌旁組織進(jìn)行Western Blot分析，結(jié)果顯示：Daam1在肺鱗癌、腺癌和癌旁正常肺組織中均有表達(dá)，分子量約為123kDa，但在癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織(P<0.01)。 對(duì)37例新鮮肺鱗癌、腺癌

7、和癌旁組織進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果顯示：Daam1在肺鱗、腺癌和癌旁正常肺組織中均表達(dá)，分子量為235kDa，但在癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織。(P=0.032)。 2、Daam1蛋白在肺癌細(xì)胞系和人支氣管上皮細(xì)胞系中的表達(dá) Daam1蛋白在5種肺癌細(xì)胞系及人支氣管上皮細(xì)胞系中均表達(dá)，但在肺癌細(xì)胞系中Daam1的蛋白表達(dá)量高于正常人支氣管上皮細(xì)胞，肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞系BE1、LH7、人肺腺癌細(xì)胞系LTE的Daam1蛋白表

8、達(dá)量明顯高于人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，人肺腺癌細(xì)胞系SPC、及人支氣管上皮細(xì)胞系HBE。經(jīng)兩兩比較，BE1、LH7、LTE和HBE之間表達(dá)Daam1蛋白的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3、Daam1 mRNA在肺癌細(xì)胞系和人支氣管上皮細(xì)胞系中的表達(dá) Daam1mRNA在5種肺癌細(xì)胞系及人支氣管上皮細(xì)胞系中均表達(dá)，但在肺癌細(xì)胞系中Daam1mRNA的表達(dá)量高于正常人支氣管上皮細(xì)胞，以肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞系低侵襲能力亞型LH7 Daam1

9、 mRNA表達(dá)量最高，其次依次為肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞系高侵襲能力亞型BE1、人肺腺癌細(xì)胞系LTE、人肺腺癌細(xì)胞系SPC、最后為腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和人支氣管上皮細(xì)胞系HBE。除人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549與人支氣管上皮細(xì)胞系HBE表達(dá)Daam1 mRNA的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P=0.299)以外，經(jīng)兩兩比較，各肺癌細(xì)胞系與HBE、以及各種肺癌細(xì)胞系之間表達(dá)Daam1 mRNA的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 然后，又采用了倍比稀釋的方法進(jìn)一步驗(yàn)證了Daa

10、m1 mRNA在各種細(xì)胞系中的表達(dá)情況。并對(duì)肺癌細(xì)胞系及人支氣管上皮細(xì)胞系中表達(dá)的Daam1 mRNA、蛋白進(jìn)行了Pearson相關(guān)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示Daam1 mRNA、蛋白在這六種細(xì)胞系中的表達(dá)具有相關(guān)性(r=0.778，p<0.01)。 結(jié)論: 1、Daam1 mRNA、蛋白在肺癌組織中的表達(dá)高于癌旁肺組織。 2、Daam1 mRNA、蛋白在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)高于支氣管上皮細(xì)胞。 3、Daam1mR