MCM7與RACK1在肺癌中表達與臨床病理因素間關(guān)系.pdf

1、目的：
　　 RACK1(receptorfor activated Ckinase 1)為有活性的蛋白激酶C受體。蛋白激酶C的激活依賴于RACK1蛋白。RACK1的功能并不局限于PKC通路,作為支架蛋白及適應(yīng)蛋白,通過不同的WD40位點,與細胞內(nèi)多種蛋白相互作用,參與細胞功能調(diào)控。微小染色體維持蛋白復合體(MCM)為DNA復制執(zhí)照系統(tǒng)成員之一,調(diào)控真核細胞的DNA復制,保證DNA復制在一個細胞周期中只有一次。MCM7為該復合體

2、的重要成分,并對維持MCM復合體的螺旋酶活性有重要意義,在控制DNA復制的過程中起關(guān)鍵作用,與細胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄、細胞增殖密切相關(guān)。
　　 我們前期通過酵母雙雜交的篩選獲得了與MCM7相互作用的蛋白,分別是張力蛋白(tensin),調(diào)寧蛋白(calponinl),紐帶蛋白(vinculin),屬于細胞膜骨架的內(nèi)收蛋白1(adducin1),層粘連蛋白1(1aminin1)等。Rack1是MCM7相互作用蛋白。蛋白激酶C激活的特征

3、是由胞漿轉(zhuǎn)至胞膜或細胞骨架,這一轉(zhuǎn)位依賴于RACK1蛋白。RACK1缺乏的細胞運動能力減弱。RACK1促進細胞增殖。MCM7與RACK1蛋白結(jié)合,RACK1磷酸化MCM7,促進細胞周期進展。
　　 有報道:RACK1抑制src激酶活性,在G1期抑制細胞生長、促進凋亡;相反:乳腺癌中RACK1與細胞增殖密切相關(guān),其高表達預(yù)后差。因此RACK1與MCM7間作用尚需進一步研究。
　　 本文應(yīng)用rt-pcr、western-bl

4、ot、免疫組化實驗檢測MCM7與RACK1在肺癌中表達,并探討二者與肺癌臨床病理因素間關(guān)系。
　　 材料與方法：
　　 1、標本來源
　　 (1)肺癌組織
　　 收集中國醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科2010年3月至2011年12月手術(shù)切除的標本,包括32例原發(fā)灶及相應(yīng)正常肺組織標本。
　　 (2)石蠟切片
　　 購買上海芯超生物科技有限公司組織芯片肺癌120點OD-CT-DgLug01-00

5、7、肺腺癌150點OD-CT-RsLug01-008、肺鱗癌150點OD-CT-RsLug01-009含有詳細病理資料及預(yù)后資料。
　　 2、試劑
　　 mousemonoclonalanti-RACK1購自BD公司,mousemonoclonalanti-MCM7購自SantaCruz公司。S-P免疫組化試劑盒(kit-9701)購自福州邁新生物科技開發(fā)有限公司,RT-PCR試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

6、>　　 3、實驗方法
　　 (1)RT-PCR
　　 收集組織標本,提取RNA,RNA定量。反轉(zhuǎn)錄,PCR。電泳后經(jīng)發(fā)光。RNA帶經(jīng)BiolmagingSystems(UVP,CA,USA)采集后進行灰度值測定,目的RNA灰度值與內(nèi)對照β-actin進行標準化后即為其相對RNA定量。
　　 (2)Westernblot
　　 收集組織標本,提取總蛋白,蛋白定量。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,然后用5%

7、BSA封閉,4℃一抗過夜,二抗37℃孵育2小時后ECL發(fā)光。蛋白條帶經(jīng)BiolmagingSystems(UVP,CA,USA)采集后進行灰度值測定,目的蛋白灰度值與內(nèi)對照β-actin進行標準化后即為其相對蛋白定量。
　　 (3)免疫組織化學(S-P)法
　　 切片常規(guī)脫蠟、水化,3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶,高溫高壓熱修復,檸檬酸鹽抗原修復液2min,蒸餾水沖洗5'×3遍、PBS沖洗5'×3遍,非免疫動物血清室溫

8、孵育10min,以封閉特異性位點,去血清加一抗MCM7(1:100)RACK1(1:200),4℃于冰箱孵育過夜,蒸餾水沖洗、PBS沖洗5'×3遍。加即用型廣譜試劑盒C液(鼠兔共用二抗)室溫孵育20min。蒸餾水沖洗、PBS沖洗5’×3遍,加即用型廣譜試劑盒D液,室溫20min。蒸餾水沖洗、PBS沖洗5'×3遍,DAB顯色。蘇木素復染,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。
　　 結(jié)果評定標準,以肺癌細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為

9、陽性表達,結(jié)合陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱兩個方面評分結(jié)果評定標準。MCM7、RACK1陽性表達根據(jù)陽性細胞百分率和染色程度進行半定量結(jié)果判定:無陽性細胞記0分,陽性細胞百分率≤50%記1分,51%-7596記2分,≥75%記3分:胞漿和/或細胞核基本不著色記0分,染色棕黃記1分,染色棕色記2分,染色褐色記3分。每張切片的陽性細胞百分率得分和染色程度等分兩項相加作為最后得分?？偡?-1分記陰性(-),2-3分記為弱陽性(+),4-5

10、分記為(++),6分以上記為強陽性(+++);以陰性至弱陽性為低表達,陽性至強陽性為高表達。
　　 4、統(tǒng)計學分析
　　 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析,數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析、相關(guān)性分析、X2檢驗、Kaplan-Meier法等。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、MCM7與RACK1在肺癌和癌旁組織中的表達
　　 對30例新鮮的腫癌和癌旁組織進行We

11、sternBlot分析,結(jié)果顯示MCM7與RACK1在肺癌和癌旁組織中均有表達,分子量MCM7約89kDa、RACK1約35kDa,但在肺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織(P＜0.01)。
　　 對30例新鮮的肺癌和癌旁組織進行RT-PCR分析,結(jié)果顯示MCM7與RACK1在肺癌和癌旁組織中均有表達,分子量MCM7約345bp、RACK1約400bp,但在肺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織(P＜0.01)。
　　 對(購自上

12、海芯超生物科技有限公司的)肺鱗癌、肺腺癌組織芯片應(yīng)用s-p法進行免疫組織化學染色,結(jié)果顯示MCM7與RACK1在肺癌和癌旁組織中均有表達,MCM7主要是細胞核表達,RACK1是細胞膜和漿表達,二者在肺癌組織中的表達均明顯高于癌旁組織(P＜0.01)。
　　 2、MCM7與RACK1二者在肺癌中表達與臨床病理因素間關(guān)系
　　 免疫組化統(tǒng)計學分析顯示,MCM7蛋白表達和RACK1蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.427,P=0.02

13、6)。兩者表達水平均與肺癌的病理分級(P=0.032,P=0.035)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移P=0.041,P=0.047)、組織分類(P=0.032),和臨床AJCC(P=0.043,P=0.036)相關(guān)。二者與患者年齡(P=0.545,P=0.606)無關(guān)。MCM7與性別(P=0.036)相關(guān),而RACK1與性別(P=0.587)無明顯相關(guān)性。
　　 3、MCM7與RACK1高表達患者生存時間縮短
　　 應(yīng)用Kaplan-Me

14、ier法分析MCM7、RACK1蛋白表達與各類型肺癌患者生存時間(P=0.006,P=0.002,Log-rank檢驗)的關(guān)系,顯示MCM7、RACK1高表達組(4-6分)生存時間明顯低于低表達組(0-3分)。
　　 4、MCM7與RACK1在肺癌中的表達正相關(guān)
　　 對MCM7與RACK1的表達進行Pearson相關(guān)性分析,Western(r=0.569,P=0.002),RT-PCR(r=0.379,P=0.047)

15、結(jié)果具有相關(guān)性。
　　 對肺癌組織芯片MCM7與RACK1蛋白表達應(yīng)用Spearman等級相關(guān)性分析,結(jié)果顯示二者具有相關(guān)性(r=0.427,P=0.026)。
　　 結(jié)論：
　　 1、MCM7與RACK1在肺癌中表達高于癌旁組織。
　　 2、MCM7與RACK1在肺癌中的表達與組織學分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和生存時間相關(guān)。
　　 3、MCM7與RACK1在肺癌中的表達具有正相關(guān)性。