PRDM14在肺癌中的表達(dá)及與臨床病理因素和生物學(xué)行為的關(guān)系.pdf

1、前言
　　 鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄抑制因子(positive regulatory domain zinc finger protein,PRDM)是一個(gè)新確認(rèn)的蛋白序列,是一個(gè)有關(guān)人類腫瘤形成的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族。盡管PRDM在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的作用還不十分清楚,但近年來研究顯示PRDM家族的成員在細(xì)胞分化和惡性變中發(fā)揮重要作用,但具體作用尚需細(xì)化研究。PRDM14是PRDM家族的成員之一。本研究采用肺癌組織標(biāo)本,檢測PRDM14在肺癌組織中的

2、表達(dá)水平,及其與臨床病理因素的關(guān)系,同時(shí)檢測PRDM14蛋白在多種肺癌細(xì)胞系中的表達(dá),研究PRDM14與肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。
　　 實(shí)驗(yàn)材料和方法
　　 一、病例和標(biāo)本
　　 70例肺癌組織石蠟標(biāo)本及7例癌旁肺組織標(biāo)本用于免疫組化檢測,標(biāo)本來自2000年11月-2006年4月于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院行肺癌切除手術(shù)的患者?；颊咝g(shù)前均未接受過放化療。患者平均年齡59歲(20歲-81歲),其中男性40例,女性30例。

3、肺癌標(biāo)本根據(jù)世界衛(wèi)生組織2004年的分類標(biāo)準(zhǔn)分為腺癌44例,鱗癌26例；其中高分化13例、中分化40例、低分化17例。40例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)1997年修訂的肺癌P-TNM分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期23例,Ⅱ期22例,Ⅲ期25例。42例肺癌及42例癌旁肺組織標(biāo)本用于western blotting檢測,標(biāo)本來自于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院行肺癌切除手術(shù)的患者?；颊咝g(shù)前均未接受過放化療。其中男性26例,女性16例。肺癌標(biāo)本根據(jù)世

4、界衛(wèi)生組織2004年的分類標(biāo)準(zhǔn)分為腺癌24例,鱗癌18例；其中高、中分化31例,低分化11例。18例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。6種肺癌細(xì)胞系分別為肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和SPC、LTE,肺鱗癌細(xì)胞系列KUM-LK2(以下簡稱為LK2),肺大細(xì)胞癌細(xì)胞系NCI-H460(以下簡稱為460),肺小細(xì)胞癌細(xì)胞系NCI-H446(以下簡稱446)；以正常支氣管上皮細(xì)胞系(human normal bronchi epithelium,HBE)細(xì)胞系為正常對照

5、。HBE細(xì)胞用含15％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,其它細(xì)胞都用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,pH值保持在pH7.2-pH7.4之間,于控制在5％CO2、37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)。
　　 二、試劑
　　 PRDM14兔抗人多克隆抗體PRDM14(ab28638)購自美國Abcam生物技術(shù)公司,SP超敏免疫組織化學(xué)試劑盒(KIT-9710)和DAB顯色試劑盒(DAB-0031)購自福州邁新生物技術(shù)公司,Triz

6、ol試劑購自美國Invitrogen公司,RPMI-1640購自GIBCO公司。
　　 三、方法
　　 應(yīng)用免疫組化SP法檢測肺癌組織及癌旁肺組織中PRDM14的表達(dá)。染色方法按SP免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行,經(jīng)檸檬酸(pH=6.0)高溫高壓修復(fù)。每張切片在顯微鏡(×400)下隨機(jī)選取10個(gè)視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞,計(jì)數(shù)其中的陽性細(xì)胞數(shù),然后取平均值。染色強(qiáng)度分級為:陰性為0,淡黃色為1,黃棕色為2,深棕色為3。

7、以陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)分級:<5％為0,5％～25％為1,25％～50％為2,>50％為3。利用染色強(qiáng)度與陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)乘積來評定結(jié)果,0為陰性,1為弱陽性,2～4為陽性,6～9為強(qiáng)陽性。western blotting的結(jié)果運(yùn)用用ECL成像系統(tǒng)(MF-chemi BIS3.2,DNR,Israel)采集圖像,測定條帶光密度值。免疫熒光結(jié)果于熒光顯微鏡(BX61FL,OLYMPUS,Japan)下觀察,用數(shù)字CCD成像裝置(DP71,OLYM

8、PUS,Japan)采集圖像,測定熒光強(qiáng)度(MetaFluor Ver.4.6.5,UIC,USA)。
　　 四、統(tǒng)計(jì)分析方法
　　 采用SPSS for Windows 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析,對PRDM14的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系采用兩組資料非參數(shù)秩和檢驗(yàn)(性別、年齡、組織學(xué)類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況)和多組資料非參數(shù)秩和檢驗(yàn)(TNM分期和分化),PRDM14在細(xì)胞系中的表達(dá)采用方差分析。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

9、。western blotting的光密度值分析采用肺癌組織和癌旁組織配對t檢驗(yàn)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 一、免疫組化
　　 70例肺鱗、腺癌組織中,有8例為PRDM14陰性表達(dá)(11.43％),9例為PRDM14弱陽性表達(dá)(12.86％),36例PRDM14陽性表達(dá)(51.43％),有17例PRDM14強(qiáng)陽性表達(dá)(24.29％)(圖1)。PRDM14在7例癌旁肺組織中弱表達(dá)。PRDM14

10、的表達(dá)情況與肺癌的分化程度(P=0.046)和組織學(xué)類型(P=0.047)相關(guān)。PRDM14的表達(dá)水平與患者的性別(P=0.820)、年齡(P=0.126)、TNM分期(P=0.052)和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.240)關(guān)系并不顯著。
　　 二、Western Blotting
　　 42例癌旁組織中33例出現(xiàn)特異性染色條帶(64KD),42例肺癌組織中36例出現(xiàn)特異性染色條帶(64KD)。對癌旁與肺癌組織的密度值與內(nèi)對

11、照密度值的比值進(jìn)行配對T檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)癌旁組織與肺鱗癌、腺癌中PRDM14的含量存在顯著性差異。PRDM14在肺鱗癌、腺癌中的表達(dá)顯著高于癌旁肺組織。
　　 三、免疫熒光
　　 在人支氣管上皮HBE細(xì)胞系中,PRDM14弱表達(dá)。PRDM14在SPC、LTE、A549、460、446、LK2不同肺癌細(xì)胞系中表達(dá)水平顯著高于HBE(P<0.001)。
　　 結(jié)論
　　 在癌旁肺組織中PRDM14弱表達(dá),肺鱗癌和肺