胃癌組織中E-cadherin和S100A2表達(dá)與其臨床生物學(xué)行為關(guān)系的研究.pdf

1、胃癌在全世界范圍內(nèi)是發(fā)病率最高的癌癥之一,但其發(fā)病機(jī)制不清,目前尚不能有效地預(yù)防其發(fā)生及治療。腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征,腫瘤轉(zhuǎn)移的研究始終是一個(gè)令人關(guān)注的重要課題。腫瘤轉(zhuǎn)移涉及許多基因的改變,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因有MMP,NM23、TIMP1、TIMP2,WDNM、H2-K、INOS、KISS1,CAV1、S100A4、MTA1、KIT和MCAM等。細(xì)胞黏附分子E-cadherin蛋白是維持上皮細(xì)胞極性及細(xì)胞間

2、連接的糖蛋白,其結(jié)構(gòu)和功能的異?？蓪?dǎo)致細(xì)胞間黏附能力減弱,在腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。S100A2是S100基因家族中的一員,是該蛋白家族中唯一與腫瘤生長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)的蛋白質(zhì)分子。S100A2基因作為候選抑癌基因,在許多惡性腫瘤中表達(dá)明顯降低,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。Tsai等研究發(fā)現(xiàn)S100A2的表達(dá)能減弱腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和侵襲能力,與腫瘤的轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)密切相關(guān)。
　　 表觀遺傳(epigenetic)的變化是

3、真核基因組一種獨(dú)特的調(diào)控機(jī)制,主要通過(guò)DNA(DNA methylation)甲基化、RNA沉默和組蛋白修飾等方式來(lái)控制基因的沉默。DNA甲基化是基因組內(nèi)一種重要的堿基修飾現(xiàn)象,是重要的表觀遺傳調(diào)控方式之一,在胚胎發(fā)育、遺傳印記和x染色體失活中發(fā)揮著重要的作用。最近10多年來(lái),通過(guò)對(duì)DNA甲基化模式的研究,人們發(fā)現(xiàn)許多種類(lèi)的癌細(xì)胞都有著異常的DNA甲基化行為,表現(xiàn)為基因組范圍的低甲基化和特異位點(diǎn)的高甲基化?；蚪M范圍的低甲基化可通過(guò)影響

4、染色體的穩(wěn)定性而啟動(dòng)癌的發(fā)生,實(shí)驗(yàn)表明鼠單純DNA低甲基化可以誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞瘤。特異位點(diǎn)的高甲基化是指腫瘤抑制基因常常被過(guò)量地甲基化而導(dǎo)致失去活性,而被看作是抑癌基因沉默的“第二次打擊”事件。如VHL,HIC-1,Rb,P15,P16等基因在許多腫瘤中發(fā)現(xiàn)他們的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生異常的甲基化。
　　 RNAi(RNA interference)技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的基因沉默技術(shù),是利用雙鏈RNA(dsRNA)特異性地降解與其同源的mRN

5、A序列,從而特異性地阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)。RNAi作為一種替代基因敲除的簡(jiǎn)單有效的工具,在功能基因組學(xué)研究、基因治療等領(lǐng)域受到越來(lái)越多的重視。
　　 目的：
　　 本研究采用半定量RT-PCR方法及免疫組化方法檢測(cè)了不同進(jìn)展時(shí)期的胃癌組織標(biāo)本、配對(duì)癌旁組織及正常胃黏膜組織E-cadherin和S100A2的表達(dá)情況,分析它們與腫瘤臨床特征的相關(guān)性,揭示了它們?cè)谖赴┻M(jìn)展中的作用;進(jìn)一步采用甲基化特異性PCR方法,檢測(cè)胃癌組織

6、標(biāo)本E-cadherin及S100A2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況,以揭示基因表達(dá)下降的機(jī)制及胃癌發(fā)病機(jī)制;采用RNAi技術(shù),在E-cadherin和S100A2表達(dá)陽(yáng)性的胃癌細(xì)胞系.MNK45細(xì)胞同時(shí)沉默E-cadherin和S100A2基因表達(dá),觀察干涉后的細(xì)胞效應(yīng),以研究E-cadherin和S100A2的功能及在胃癌發(fā)生中的作用機(jī)制。
　　 材料及方法：
　　 1、實(shí)驗(yàn)材料
　　 ①組織標(biāo)本:不同進(jìn)展期胃癌組織

7、標(biāo)本64例,正常胃粘膜標(biāo)本15例,均來(lái)自遼寧省腫瘤醫(yī)院。
　　 ②細(xì)胞株:MKN-45,來(lái)源于低分化腺癌,來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物教研室
　　 ③質(zhì)粒:pNeo-RNAi-E-cadherin siRNA,pNeo-RNAi-S100A2 siRNA表達(dá)載體由美國(guó)加州大學(xué)惠贈(zèng)。
　　 2、實(shí)驗(yàn)方法
　　 ①半定量RT-PCR:Trizol試劑提取組織標(biāo)本和細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,PCR擴(kuò)增E-ca

8、dherin和S100A2特異性片段,以β-actin為內(nèi)對(duì)照,進(jìn)行半定量分析。
　　 ②免疫組化:制備組織標(biāo)本石蠟切片,用E-cadherin和S100A2特異性抗體進(jìn)行雜交,統(tǒng)計(jì)分析蛋白和基因表達(dá)與臨床特征間的相關(guān)性。
　　 ③甲基化特異性PCR:酚氯仿提取胃癌組織標(biāo)本DNA,亞硫酸鹽修飾DNA后,純化產(chǎn)物。用甲基化特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 ④Western Blot:檢測(cè)

9、RNA干涉后MKN-45細(xì)胞中E-cadherin和S100A2蛋白表達(dá)情況。
　　 ⑤MTT實(shí)驗(yàn):檢測(cè)RNA干涉后MKN-45細(xì)胞增殖情況。
　　 ⑥Transwell實(shí)驗(yàn):分析RNA干涉后細(xì)胞侵襲力的變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、E-cadherin RT-PCR結(jié)果:正常對(duì)照胃黏膜組織E-cadherin基因表達(dá)陽(yáng)性率為100％,不同進(jìn)展期的胃癌組織基因表達(dá)的陽(yáng)性率下降。E-cadherin在

10、64例胃癌的表達(dá)量為1.245±0.153,而正常胃組織的E-cadherin表達(dá)量為2.105±0.216,差異有顯著(P＜0.01)。
　　 2、S100A2 RT-PCR結(jié)果:正常對(duì)照胃黏膜組織基因表達(dá)陽(yáng)性率為100％,不同進(jìn)展期胃癌組織基因表達(dá)的陽(yáng)性率下降。S100A2在64例胃癌的表達(dá)量為1.877±0.224,而正常胃組織的S100A2表達(dá)量為2.387±0.293,差異有顯著性(P＜0.01)。
　　 3、

11、E-cadherin免疫組化結(jié)果:E-cadherin主要表達(dá)在細(xì)胞膜,細(xì)胞漿中有少量表達(dá)。結(jié)果顯示正常胃黏膜組織蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為100％,64例胃癌組織中蛋白表達(dá)陽(yáng)性率下降為71.87％(46/64)。
　　 4、S100A2免疫組化結(jié)果:陽(yáng)性表達(dá)見(jiàn)于腺上皮細(xì)胞的胞漿和胞核。15例正常胃黏膜組織蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為100％,胃癌組織中蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為62.5％(40/64),明顯低于正常胃黏膜組織。
　　 5、E-cadh

12、erin的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系:E-cadherin在不同分化程度,不同浸潤(rùn)深度的胃癌中表達(dá)差異有顯著性(P＜0.05);在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例組中,E-cadherin的表達(dá)量差異有顯著性(P＜0.01),而在不同生長(zhǎng)方式上表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而E-cadherin蛋白在各種臨床特征分組上表達(dá)差異均具有顯著性(p＜0.01)
　　 6、S100A2的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系:S100A2在不同分化程度

13、,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例組中胃癌中表達(dá)差異有顯著性(P＜0.01);在不同浸潤(rùn)深度的胃癌組織中表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05),而S100A2的表達(dá)量在不同生長(zhǎng)方式上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),而S100A2的表達(dá)在各臨床特征分組上表達(dá)差異均具有顯著(p＜0.01,P＜0.05)
　　 7、E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性PCR擴(kuò)增結(jié)果:64例胃癌組織標(biāo)本甲基化比率為59.38％(38/64),

14、正常胃粘膜組織甲基化比率為13.3％(2/15).
　　 8、S100A2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性PCR擴(kuò)增結(jié)果:64例胃癌組織標(biāo)本甲基化比率為56.25％(36/64),正常胃粘膜組織甲基化比率為13.3％(2/15)。
　　 9、胃癌組織中E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與胃癌生物行為的關(guān)系:E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化在高、中分化組,低、未分化胃癌組織中差異顯著(p＜0.01)。淋巴轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組、浸潤(rùn)

15、深度漿膜外組甲基化程度高于相對(duì)應(yīng)的陰性組及漿膜內(nèi)組,差異顯著(p＜0.01)。在生長(zhǎng)方式特征上,兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 10、胃癌組織中S100A2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與胃癌生物行為的關(guān)系:S100A2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化在低、未分化,高、中分化組胃癌組織中差異顯著(p＜0.05)。淋巴轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組、浸潤(rùn)深度漿膜外組甲基化程度高于相對(duì)應(yīng)的陰性組及漿膜內(nèi)組,差異顯著(p＜0.01,p＜0.05)。在生長(zhǎng)方式特征上,兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。<

16、br>　　 11、siRNA對(duì)MKN45細(xì)胞E-cadherin和S100A2 mRNA表達(dá)明顯抑制:RNAi第7天RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果與對(duì)照相比E-cadherin和S100A2 mRNA表達(dá)明顯抑制。
　　 12、siRNA對(duì)MKN45細(xì)胞E-cadherin和S100A2蛋白表達(dá)的影響:siRNA干涉第7天,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比E-cadherin和S100A2蛋白表達(dá)無(wú)明顯減弱;干涉第10天,實(shí)驗(yàn)組大約90％細(xì)胞蛋白表達(dá)

17、減弱,表明E-cadherin和S100A2蛋白表達(dá)受到抑制。
　　 13、E-cadherin和S100A2蛋白表達(dá)下調(diào)對(duì)細(xì)胞增殖的影響:MTT實(shí)驗(yàn)顯示E-cadherin和S100A2表達(dá)抑制后細(xì)胞生長(zhǎng)速度增加。將pNeo-RNAi-E-cadherin和pNeo-RNAi-S100A2重組載體轉(zhuǎn)染MKN45細(xì)胞后,細(xì)胞生長(zhǎng)率逐漸增加,第7天和10天增長(zhǎng)率分別為12％和25％(P＜0.05)。
　　 14、E-cad

18、herin和S100A2蛋白表達(dá)下調(diào)對(duì)細(xì)胞侵襲力的影響:干涉第11天,E-cadherin和S100A2蛋白表達(dá)下調(diào),細(xì)胞侵襲力明顯增加。干涉前后都有細(xì)胞穿透濾膜,但干涉后細(xì)胞數(shù)明顯高于干涉前,細(xì)胞數(shù)分別為49±5和68±8,兩組有顯著差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、E-cadherin和S100A2在胃癌組織中表達(dá)均下降,是腫瘤抑制因子。
　　 2、E-cadherin和S100A2的表達(dá)與胃癌