Bcl-2和CyclinE在肺癌發(fā)生及生物學行為中的作用.pdf

1、背景與目的: 肺癌是一種死亡率、發(fā)病率極高的惡性腫瘤。近年來許多國家對于肺癌的控制以及治療投入了巨大的財力物力，但是其發(fā)病率及死亡率仍然在不斷上升。2008年11月第八個“全球肺癌關注月”，世界衛(wèi)生組織年鑒表明：近幾年，肺癌以歐美國家高發(fā)，在據(jù)統(tǒng)計的50個國家和地區(qū)中，肺癌居惡性腫瘤首位的有36個國家和地區(qū)。而肺癌已成為中國的第一大癌，衛(wèi)生部公布的《2006年城鄉(xiāng)居民主要死亡原因》顯示，我國肺癌的調整發(fā)病率已高達61.4/10萬

2、，更令人憂慮的是，肺癌發(fā)病率仍呈現(xiàn)著不斷攀升的趨勢，2015年，我國將成為世界第一肺癌大國。 肺癌在病理學上可分為鱗癌、腺癌、大細胞肺癌和小細胞肺癌；按類型分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌。小細胞肺癌占全部的肺癌的12％～15％，小細胞肺癌是一種惡性程度很高的腫瘤，生長迅速，容易早期全身轉移，而且小細胞肺癌是所有治療敏感的腫瘤中最難治愈的一種。 當今社會生活中健康已成為人類的第一需求。人類為征服癌癥不斷地進行著努力。隨著社會

3、的發(fā)展和科技的進步，人類對機體的生長發(fā)育、遺傳與進化、免疫防御、衰老死亡等生命現(xiàn)象的認識有了突破性的進展，而且人類在病毒與腫瘤、細胞分化與腫瘤、細胞周期與腫瘤、癌基因、抑癌基因、信號傳導與腫瘤和新生血管形成與腫瘤轉移等方面也取得進展。目前，普遍認為不可控制的細胞增生是惡性腫瘤的主要特征。腫瘤的惡性增生從生物學角度看主要表現(xiàn)在兩個方面：一方面是腫瘤細胞的不滅性即凋亡障礙；另一方面是細胞分裂的失控即細胞周期網(wǎng)絡調控系統(tǒng)的障礙，這兩方面都是目

4、前分子腫瘤學研究的熱點。 凋亡障礙常有癌基因和蛋白的參與。bcl—2(B—cell lymphoma—2)基因發(fā)現(xiàn)于t(14；18)染色體易位的B細胞淋巴瘤，與其他癌基因不同，bcl—2的作用是抑制細胞的凋亡而不是促進細胞的增殖。Bcl—2蛋白通過抑制促凋亡蛋白Bax和Bak的活性，抑制細胞凋亡。因凋亡作用的減弱不能及時清除細胞周期紊亂和具有突變傾向的細胞，故抗凋亡蛋白的過度表達與腫瘤的發(fā)生密切相關。研究顯示，多種腫瘤細胞中有B

5、cl—2蛋白的表達增加。 細胞周期調控異常不僅是腫瘤發(fā)生的重要前提，而且也是促進腫瘤惡性增殖和轉移的重要因素。細胞周期有兩個重要的轉換點即G1/S和G2/M。在它們的轉換中都設有設有存在檢查點。控制這些檢查點即可以實現(xiàn)對細胞周期的調控。有一些學者認為腫瘤發(fā)生的最根本的原因是這兩個檢查點的失控使得原本應該停止增生的細胞或生理凋亡的細胞不停的進入細胞周期因而導致細胞的惡性增生。腫瘤的發(fā)生是正常染色體多重損傷的復雜過程，其最終表現(xiàn)為細

6、胞周期調控機制的紊亂，分化受阻細胞表現(xiàn)為無限制自主的增生和分裂。細胞周期調控異常主要表現(xiàn)為細胞周期時相的變化和相關調控因子——細胞周期蛋白(cyclins)、細胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)及其抑制劑(CKIs)的表達異常。CyclinE屬于細胞周期G1期的正性調節(jié)因子，主要參與細胞周期G1/S期轉換的調控，并與其他調控因子cyclinD、視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(Rb)、轉錄因子E2F、抑癌基因表達產物p53、Kip家族、CDK2、4、6

7、等相互作用決定細胞的生存與凋亡。cyclinE在細胞周期的G1晚期和S期表達，且在G1/S期達到峰值。CyclinE蛋白的過早及過高表達可加速細胞進入S期，促進細胞的增殖。CyclinE—CDK2復合物的作用被認為是啟動DNA復制及進入S期的重要調節(jié)因素，而其作用與細胞中的cyclinE的表達水平及CDK2的激酶活性密切相關。G1期的縮短，減少了細胞對生長因子的依賴性，從而有利于腫瘤的發(fā)生。在一些研究報道中，大多數(shù)腫瘤包括肝癌、鼻咽癌、

8、卵巢癌、乳腺癌及胰腺癌中都有cyclinE的過度表達，并且在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌中，cyclinE還被認為與腫瘤發(fā)生密切相關，并作為預示腫瘤發(fā)展的一項獨立指標。 此外，cyclinE與腫瘤血管的生成和腫瘤的轉移關系密切。有研究表明CyclinE可能是通過以下兩種可能的機制參與轉移：其一是cyclinE—CDK2復合物的靶蛋白參與細胞黏附的丟失，其表現(xiàn)為有絲分裂相關的細胞遷移性增加；其二，最新的研究證據(jù)表明，cyclinE基因的

9、過度表達影響了染色體的穩(wěn)定性。高水平表達的cyclinE蛋白影響S期進程，可產生非整倍體細胞。在腎癌、胰腺癌、B—細胞淋巴瘤等腫瘤的研究中，已發(fā)生轉移病例的cyclinE蛋白的表達明顯高于未發(fā)生轉移的病例，并與腫瘤的病理、臨床分級相吻合，直接影響患者的預后。 目前在有關肺癌的研究中，對于Bcl—2蛋白的研究多集中于鱗癌、腺癌，小細胞肺癌及小細胞肺癌細胞系的研究報道相對較少。有關CyclinE蛋白的研究多以消化道腫瘤和婦科腫瘤為主

10、，但CyclinE蛋白與肺癌發(fā)生和發(fā)展關系的研究少見。因此，本研究以大細胞和小細胞肺癌細胞系做為研究對象，主要檢測Bcl—2蛋白和CyclinE蛋白在肺癌細胞中的表達變化，并探討其在肺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用及其與生物學行為之間的關系。 方法: 1.細胞培養(yǎng)，MRC—5細胞在含10％小牛血清的MEM培養(yǎng)液、H460和H446細胞在含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液、在飽和濕度、在37℃、5％CO2孵箱中傳代培養(yǎng)。

11、 2.應用Western—blot法檢測Bcl—2蛋白在MRC—5、H460和H446三種細胞內的表達差異。 3.以H460細胞系為標準，通過噻唑藍(MTT)比色實驗檢測細胞的生長和增殖情況，并繪制生長曲線，篩選UV照射細胞的劑量和后續(xù)培養(yǎng)時間。 4.應用免疫組化法檢測MRC—5、H460和H446三種細胞在UV照射后不同培養(yǎng)時間下Bcl—2蛋白的表達差異。 5.應用雙重胸腺嘧啶核苷(TdR)對細胞進行同步化處

12、理。 6.應用流式細胞術檢測胸腺嘧啶核苷(TdR)誘導細胞同步化的效果。 7.應用Western—blot法檢測同步化后MRC—5、H460和H446三種細胞內CyclinE蛋白的表達差異。 結果: 1.Western—blot法檢測Bcl—2蛋白的表達 Bcl—2蛋白在MRC—5、H460和H446三種細胞中的表達有明顯差別(P<0.01)，測得肺腫瘤細胞系H460和H446的Bcl—2蛋白表

13、達灰度值分別為MRC—5的6.10倍和4.60倍。 2.篩選UV照射的時間和劑量 (1)培養(yǎng)時間固定，UV照射劑量分別為20s、40s、60s和80s時，隨著照射劑量的增大，細胞的增殖明顯下降，并且80s照射劑量的細胞死亡較多。說明UV照射對細胞的增殖抑制有劑量依賴性，但較大劑量可致細胞死亡。 (2)當UV照射劑量固定(60s)，進一步細化后續(xù)培養(yǎng)時間，發(fā)現(xiàn)在10.5小時時細胞增殖達最大抑制。 3.免疫組

14、化法檢測UV照射后細胞中Bcl—2蛋白的表達 UV照射后，MRC—5、H460和H446三種細胞系中Bcl—2蛋白的表達水平均較未經UV照射的細胞有明顯升高。隨著照射后培養(yǎng)時間的延長，陽性細胞的比例增加并且陽性細胞的顏色加深，尤其是在培養(yǎng)10.5h后，那些已與周圍失去粘連作用的細胞均呈深棕色，提示Bcl—2蛋白的表達與照射后的培養(yǎng)時間正相關。 4.流式細胞術檢測細胞同步化結果 胸腺嘧啶核苷誘導的細胞經流式細胞儀

15、檢測的結果顯示，各組細胞80％以上處于G1期，10％左右處于S期，僅有一小部分細胞處于G2和M期，表明各組細胞已經同步化于G1/S期。 5.蛋白印跡檢測結果 MRC—5、H460和H446三種細胞中CyclinE蛋白的表達水平有明顯差別(P<0.01)，肺腫瘤細胞系H460和H446CyclinE蛋白表達的灰度值分別是肺正常細胞MRC—5的10.59倍和5.72倍。 結論: 1.Bcl—2蛋白的過表達與