觀賞向日葵花色形成的機(jī)理研究.pdf

1、觀賞向日葵(Helianthus annuus)在歐美等國市場由來已久，既可作切花，也是用于園林布置。近年來觀賞向日葵作為國內(nèi)新興的觀賞植物，逐漸受到我國消費(fèi)者的喜愛。類黃酮化合物是植物次生代謝產(chǎn)物的一部分，大部分花色都是由這類化合物的生成而產(chǎn)生的?；ㄉ剀帐穷慄S酮類化合物中最重要的一類化合物。目前人們對花色素苷的生物合成途徑已有詳細(xì)的研究，該途徑中幾乎所有的基因包括一些調(diào)節(jié)基因均已分離。但有關(guān)觀賞向日葵花色形成的機(jī)理研究尚未見報(bào)道。因

2、此開展觀賞向日葵花瓣色素成分分析以及花色素苷生物合成相關(guān)基因的克隆與表達(dá)對于闡明觀賞向日葵花色形成的機(jī)理、利用基因工程培育新品種等具有廣泛的應(yīng)用前景。 本論文主要研究內(nèi)容包括：(1)以不同花色品種的觀賞向日葵為材料，分析不同播期下觀賞向日葵的生長發(fā)育特性及其適應(yīng)性；(2)通過特征顏色反應(yīng)、紫外--可見光譜等多種植物成分分析方法檢測觀賞向日葵花瓣色素中的各主要成分以及觀賞向日葵花色素苷在不同光溫條件下的穩(wěn)定性：(3)根據(jù)已克隆的花

3、色素苷生物合成相關(guān)基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR克隆觀賞向日葵花色素苷生物合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因，并利用半定量RT-PCR檢測花色素苷合成相關(guān)基因在不同器官、不同花發(fā)育時期和不同顏色花瓣中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況；(4)利用電子延伸技術(shù)分離觀賞向日葵osDFR基因的編碼區(qū)序列，并對所獲得的osDFR基因進(jìn)行Southern雜交分析、原核表達(dá)分析，以及利用PCR技術(shù)對osOFR基因的底物結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變。主要研究結(jié)果如下： (1

4、)篩選6個具有典型花色的觀賞向日葵品種為試驗(yàn)材料，于春、夏、秋、冬等4個播期下研究觀賞向日葵的生長發(fā)育特性。不同播期觀賞向日葵的不同生育階段和生物學(xué)性狀間的相關(guān)系數(shù)有較大的顯著性差異；不同生育期和生物學(xué)性狀組合間的典范相關(guān)分析表明春播植株主要表現(xiàn)在主要集中于全生育期與單株成花分枝數(shù)、花期與單株花數(shù)的相互關(guān)系上，夏播植株主要表現(xiàn)在營養(yǎng)生長期與單株分枝數(shù)、籽粒成熟期與單株花數(shù)的相互關(guān)系上，秋播植株主要表現(xiàn)在全生育期與成花分枝數(shù)和莖粗的相互關(guān)

5、系上，冬播植株主要表現(xiàn)在全生育期和花期與單株花數(shù)，籽粒成熟期與成花分枝數(shù)的相互關(guān)系上。由3-6月播期下的觀賞向日葵株高的生長散點(diǎn)圖以及擬合回歸方程可知，Logistic模型較好地反映觀賞向日葵株高的生長動態(tài)變化。3個花色品種株高生長存在一定的差異，‘Valentine’品種株高的極限生長量最大，‘Joker’品種的極限生長量最小。4月份播期的株高生長較為迅速，6月份播期株高生長量明顯減緩，并且較早進(jìn)入生長的緩慢停滯期。不同播期下觀賞向日

6、葵的株型亦存在較大的變異。 (2)觀賞向日葵花瓣色素的化學(xué)顯色反應(yīng)表明花瓣中主要是以類黃酮為母核的一類物質(zhì)，以黃酮、黃酮醇、二氫黃酮醇為主，其中‘Joker’和‘Ring of Fire’品種中還可能含有花色素苷。紫外．可見光光譜分析表明觀賞向日葵4個品種的花瓣色素中均可能含有二氫黃酮醇類物質(zhì)，而紅色系列的‘Joker’和‘Ring of Fire’品種在530nm附近的可見光范圍內(nèi)還有最大吸收波長，其花瓣色素中可能含有花色素苷

7、類物質(zhì)。HPLC-MS技術(shù)檢測表明觀賞向日葵‘Ring of Fire’品種花瓣花色素中可能含有帶有雙糖(葡萄糖與阿拉伯糖)的天竺葵色素苷；‘J0ker’品種中可能含有錦葵素-3-蕓香糖苷和矢車菊素-3-葡糖苷；而‘Ikarus’和‘VMentme’品種中可能均含有紅花苷；4個花色品種可能均含有二氫槲皮素-3-葡糖苷。對提取的花瓣色素進(jìn)行了光溫穩(wěn)定性研究，發(fā)現(xiàn)避光條件下觀賞向日葵花瓣花色素苷的穩(wěn)定性要強(qiáng)于光照條件。觀賞向日葵紫紅色和紅褐

8、色花瓣花色素苷在溫度變化過程中穩(wěn)定性較差，具有一定的波動性；但在一定溫度范圍內(nèi)，花色素苷含量并沒有隨著溫度的提高而減少。 (3)根據(jù)已發(fā)布的基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)了特異引物或簡并引物，從觀賞向日葵紫紅色品種‘Ring of Fire’花瓣中成功獲得了PAL(Genank登錄號：EF566469)、CHS、CHI(Genbank登錄號：EU366166)、F3'H(Genbank登錄號：EU366167)、DFR(Genbank登錄號：

9、EF492066)和ANS(Genbank登錄號：DQ884194)等花色素苷生物合成途徑中6個結(jié)構(gòu)基因的保守序列。序列分析表明6個結(jié)構(gòu)基因與其它植物來源的花色素苷生物合成相關(guān)基因均具有較高的同源性。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明6個結(jié)構(gòu)基因的系統(tǒng)進(jìn)化基本上符合植物分類學(xué)分類；除CHI外的2個上游基因(PAL、CHS)的進(jìn)化速率要低于3個下游基因(F3'DFR，ANS)。半定量RT-PCR分析結(jié)果除CHS基因在管狀花花瓣中未表達(dá)外，其它5個基因在舌狀

10、花花瓣、管狀花花瓣、花蕾、葉片、莖皮中均有表達(dá)，表明花色素苷合成相關(guān)基因的表達(dá)沒有器官特異性。但花色素苷合成相關(guān)基因在花組織(舌狀花、管狀花、花蕾)中的表達(dá)量要高于其它器官，且以在花蕾中的表達(dá)量最高。觀賞向日葵花色素苷合成相關(guān)基因的表達(dá)同花發(fā)育緊密相關(guān)，即大部分結(jié)構(gòu)基因在花開放初期和盛期的表達(dá)較高；花完全開放后，所有基因的轉(zhuǎn)錄水平均降低。觀賞向日葵花色素苷合成相關(guān)基因的表達(dá)與花瓣顏色的深淺存在一定的關(guān)系。CHI基因除在紅褐色花瓣中具有較

11、高的表達(dá)外，在其它顏色的花瓣中很低。F3'H基因在紫色系列(‘Ring of Fire’、‘Moulmg Rouge’)的花瓣中的表達(dá)分別高于紅色系列(‘Joker’、‘AutumnBeauty’)花瓣。DFR和ANS基因在深色花瓣中(‘Mouling Rouge’和‘AutumnBeauty’)的表達(dá)均高于混雜色的花瓣(‘Ring of Fire’和‘Joker’)。 (4)利用EST數(shù)據(jù)庫以及已克隆的DFR基因保守序列，進(jìn)行

12、電子延伸后結(jié)合PCR技術(shù)成功克隆到觀賞向日葵osOFg基因的編碼區(qū)。osDFR基因推導(dǎo)氨基酸序列分析表明觀賞向日葵osDFR基因5'端具有NADP結(jié)合位點(diǎn)，其134位氨基酸為天冬酰胺，因此觀賞向日葵‘Ring of Fire’品種中可能是以DHK為DFR酶的作用底物。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明DFR蛋白依據(jù)單子葉和雙子葉植物劃分為兩類，與植物分類學(xué)分類基本一致。osDFR基因在觀賞向日葵4個花色品種花瓣基因組中至少有1個以上的拷貝數(shù)。 本