足細胞及相關(guān)分子Nephr in、WT1、PCX在糖尿病腎病發(fā)病中的作用以及氯沙坦對其干預的研究.pdf

1、研究背景與目的：糖尿病腎病(DN)是糖尿病的慢性并發(fā)癥，糖尿病腎病的發(fā)病機制至今未完全闡明。蛋白尿是糖尿病腎病的主要臨床表現(xiàn)，也是引起腎臟損傷的獨立危險因素，蛋白尿的發(fā)生與腎小球濾過屏障有關(guān)。由足細胞及其相關(guān)分子構(gòu)成的腎小球濾過屏障的結(jié)構(gòu)和功能障礙在DN蛋白尿的形成中起著重要作用，是近來的研究熱點。 本研究建立糖尿病大鼠模型，從不同時間點動態(tài)觀察腎小球足細胞數(shù)量和密度的變化、足細胞相關(guān)分子nephrin、WT1、PCX在腎組織中

2、的表達以及nephrin在尿中的排泄，探討足細胞及相關(guān)分子在DN蛋白尿發(fā)生發(fā)展中的改變及意義。同時應用氯沙坦對不同時期DN給藥進行干預，了解其對足細胞及相關(guān)分子的影響，探討氯沙坦降低尿蛋白、保護腎功能的機理，為DN的發(fā)病機制、診斷和防治提供理論依據(jù)。 方法：采用一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病大鼠模型，將糖尿病模型大鼠隨機分為糖尿病非干預組(DM組)、早期氯沙坦干預組(DL1組，實驗初予氯沙坦30mg/kg·d)、中

3、期氯沙坦干預組(DL2組，實驗開始4W后予氯沙坦30mg/kg·d)，以正常大鼠作對照組(NC組)。NC組及DM組分別于2、4、6、8、12周測尿白蛋白(UA)，血糖(BG)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、尿肌酐(Ucr)，計算血清肌酐清除率(Ccr)，取腎組織行常規(guī)病理檢查，免疫組化、Western-Blot分析技術(shù)檢測腎臟nephrin、WT1、PCX的表達，Western-Blot分析技術(shù)檢測nephrin在尿中排泄。DL

4、1、DL2組于實驗末(12W)收集標本，觀察指標同DM組。 結(jié)果： 1.與NC組相比，DM組和DL1、DL2組的BG明顯升高(P＜0.01)，DM組和DL1、DL2組的BG水平無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。 2.DM組尿白蛋白(mg/L)排泄逐漸增多，2W與對照組比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，4W高達72.21：1：8.24，顯著高于對照組6.87：t：0.67(P＜0.05)，直至12W，表明糖尿病大鼠成模

5、4W后出現(xiàn)糖尿病腎病。DM組BUN(mmol/l)漸增高，2W與對照組比較無統(tǒng)計學差異，4W達10.24：t：0.46，明顯高于對照組5.34+0.23(P＜0.05)，直至12W。DM組Cer(ml/min·Kg)漸下降，6W達3.27+0.26，與對照組(6.78-4-0.37)比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，糖尿病腎病白蛋白尿早于BUN、Ccr異常的出現(xiàn)。DLl組、Di.2組尿白蛋白分別為98.54+22.37、112.76+2

6、1.74，低于同期DM組211.35±18.23(均P＜0.05)；BUN分別為12.27±1.64、13.09±1.58，低于同期DM組15.33±1.76(均P＜0.05)；Ccr分別為3.26±0.68、2.76±0.74較同期DM組1.93±0.37升高(P＜0.05)，但DL1與DL2組間比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。 3.DM組2W開始出現(xiàn)腎小球足細胞密度(WT1陽性細胞面積/腎小球面積％)降低(17.6±0.9

7、3)，與NC組(29.4±1.21)比較，P＜0.05。腎小球足細胞計數(shù)(個/1000urn2腎小球)于4W出現(xiàn)明顯下降，與NC組相比差異有顯著性【(13.6±2.04)比(18.2±2.13)，P＜0.05】。免疫組化分析各指標的陽性區(qū)平均積分光密度及Western-Blot分析各指標的吸光度值，結(jié)果顯示：與NC組相比，DM組足細胞相關(guān)分子nephrin、WT1、PCX蛋白均于2W出現(xiàn)表達下調(diào)，分別為nepbxin[免疫組化(50.0

8、7±1.83)比(55.24±1.96)，P＜0.05；Western.Blot(0.36±0.121)比(0.54±0.137)，P＜0.05】；WT1[免疫組化(19.37±2.09)比(25.67±2.01)，P＜0.05；Western.Blot(0.14±0.048)比(0.23±0.059)，P＜0.05】；PCX【免疫組化(68.19±1.86)比(71.35±1.67，P＜0.05；Westem．Blot(0.51±0.

9、186)比(0.77±0.205)，P＜0.05】。隨著時間的進展，腎小球足細胞密度、足細胞計數(shù)、相關(guān)分子nephrin、WT1、PCX蛋白的表達進一步減少，直至12W，各周間比較差異有顯著性(P＜0.05)。氯沙坦治療后腎小球足細胞的密度、足細胞的數(shù)量、nephrin、WT1、PCX的表達均出現(xiàn)上調(diào)，各指標DLl組分別為14.3±0.98、11.4±1.97、36.67±2.05、14.53±2.36、46.74±1.98，DL2組分

10、別為13.5±1.14、10.9±2.03、34.83±1.98、13.48±2.24、44.29±1.83，與同期DM組各相應指標(分別為7.2±0.96、5.0±2.01、9.93±1.95、3.56±1.76、11.35±1.67)比較，P＜0.05。DL1組比DL2治療組上調(diào)增加，但兩組比較差異無統(tǒng)計學意義，P＞0.05。 4.NC組大鼠尿中無nephfin，DM組大鼠尿中可出現(xiàn)nephrin，最早出現(xiàn)在2W，此時，尿中

11、白蛋白增加尚不明顯，隨著病程的延長，尿中白蛋白明顯增多，尿中nephrin也逐漸增多，8W達高峰后又漸減少。 5.相關(guān)分析顯示：尿白蛋白排泄分別與足細胞計數(shù)、足細胞密度、足細胞相關(guān)分子nephrin、WT1、PCX呈負相關(guān)(r=0.736，P＜0.01；r=-0.578，P＜0.05；r=-0.863，P＜0.01；r=-0.758，P＜0.01；r=-0.776，P＜0.01)。 結(jié)論： 1.糖尿病大鼠早期(2

12、w)出現(xiàn)腎小球足細胞密度減低，足細胞相關(guān)分子nephrin、WT1、PCX表達下調(diào)，是糖尿病腎病早期損傷指標，足細胞及其相關(guān)分子nephrin、WT1、PCX蛋白參與了糖尿病腎病大鼠蛋白尿的發(fā)生及發(fā)展。 2.氯沙坦通過延緩或抑制足細胞的丟失、維護正常足細胞數(shù)量，以及抑制糖尿病大鼠腎小球足細胞nephrin、wTl、PCX表達下調(diào)來減少尿蛋白、延緩DN進展。對已形成的糖尿病腎病氯沙坦治療同樣有效。 3.糖尿病腎病早期nep