谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶Mu亞型在糖尿病腎病發(fā)病中的作用及干預(yù)治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、糖尿病腎病是糖尿病患者最主要的微血管病變，發(fā)病率高，美國(guó)疾病控制中心資料顯示，DN患者約占DM總?cè)藬?shù)的67％以上。據(jù)美國(guó)、日本及許多西歐國(guó)家統(tǒng)計(jì)資料表明，DN已經(jīng)上升為終末期腎臟病的首位病因，在美國(guó)、日本的透析患者中，DN患者所占比例接近50％。隨著生活水平的提高和生活方式的變化，我國(guó)DM和DN發(fā)病率也成上升趨勢(shì)。目前臨床上早期診斷DN的主要依據(jù)是微量蛋白尿，而DM患者一旦出現(xiàn)微量蛋白尿，約有30～45％的DN患者將不可避免地進(jìn)展到明顯

2、蛋白尿進(jìn)而發(fā)展至慢性腎功能衰退及ESRD。由于DN患者機(jī)體存在極其復(fù)雜的代謝紊亂，一旦發(fā)展至終末階段，往往比其他腎臟疾病治療更加棘手。而目前臨床尚缺乏針對(duì)DN有效的特異性治療。由于DM患者，尤其是2型DM患者常伴有代謝綜合征的其他表現(xiàn)，如高血壓、高脂血癥、中心性肥胖等，因此臨床上針對(duì)DN的治療以綜合治療為主，包括控制血糖、控制血壓、降脂治療及終末期替代治療等，而治療費(fèi)用昂貴、療效差和患者病死率高，一直是糖尿病領(lǐng)域和腎臟病領(lǐng)域?qū)W者面臨的問(wèn)

3、題。進(jìn)一步探索DN的發(fā)病機(jī)制，以便制定更加有效的防治措施無(wú)疑是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界急待解決的重大課題。
　　 DN發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，包括了眾多因素參與?？偟膩?lái)說(shuō)，它是起始于糖代謝障礙所致的血糖過(guò)高，在一定遺傳背景以及一些相關(guān)的獲得性危險(xiǎn)因子參與下，通過(guò)啟動(dòng)許多細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，終于造成腎臟的損害。雖然有關(guān)DN的研究取得了很大的進(jìn)展，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在腎臟領(lǐng)域的研究逐漸增多，這對(duì)于深入了解腎臟的生理功能、揭示腎臟

4、病的發(fā)病機(jī)理、發(fā)現(xiàn)新的診斷標(biāo)志物以及識(shí)別新的治療靶點(diǎn)有著深遠(yuǎn)的意義。而蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)也為深入研究DN發(fā)病機(jī)制提供了全新的方法。
　　 本論文我們利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎組織蛋白質(zhì)差異表達(dá)進(jìn)行了研究，并進(jìn)一步對(duì)其中的差異表達(dá)蛋白——谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶Mu亞型在DN進(jìn)展中的作用及干預(yù)治療的意義進(jìn)行了探討。
　　 第一部分 GSTM在STZ誘導(dǎo)的DM大鼠腎臟表達(dá)的研究
　　 研究背景和目的：

5、　　 隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃工作的完成，生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)開(kāi)始在基因水平對(duì)各種疾病進(jìn)行深入的研究，但人們也逐漸認(rèn)識(shí)到基因只是遺傳信息的載體，而生理活動(dòng)的執(zhí)行者是基因的表達(dá)產(chǎn)物——蛋白質(zhì)，要研究生命現(xiàn)象、闡明生命活動(dòng)規(guī)律，需要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行全面的研究。只有對(duì)蛋白質(zhì)數(shù)量、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、相互關(guān)系和生物功能全面認(rèn)識(shí)，才能揭開(kāi)生命現(xiàn)象的本質(zhì)。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)已成為“后基因組時(shí)期”生物醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)內(nèi)容之一。
　　 近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在腎臟領(lǐng)域

6、的研究也逐漸增多，這對(duì)于深入了解腎臟的生理功能、揭示腎臟病的發(fā)病機(jī)理、發(fā)現(xiàn)新的診斷標(biāo)志物以及識(shí)別新的治療靶點(diǎn)有著深遠(yuǎn)的意義。而蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)也為深入研究DN發(fā)病機(jī)制提供了全新的方法。
　　 論文第一部分我們利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎組織蛋白質(zhì)差異表達(dá)進(jìn)行了研究，以尋求糖尿病腎病可能的發(fā)病機(jī)制和治療的新靶點(diǎn)。
　　 材料和方法
　　 健康雄性Wistar大鼠40只，隨機(jī)選取12只作為正常對(duì)照組，其

7、余28只用來(lái)建立糖尿病大鼠模型，作為糖尿病組。正常對(duì)照組一次性尾靜脈注射0.1％檸檬酸緩沖液，DM組一次性尾靜脈注射0.1％STZ檸檬酸緩沖液55mg/kg，5天后取鼠尾血測(cè)定血糖，篩選模型成功的大鼠。以STZ注射5天后空腹血糖水平≥16.7mmol/L為糖尿病模型成功的標(biāo)準(zhǔn)。所有大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，持續(xù)觀察24周。于第24周末處死大鼠，取血測(cè)定空腹血糖、尿素氮、肌酐、白蛋白、尿酸、總膽固醇、甘油三酯、糖基化血紅蛋白和晚期糖基化

8、終末產(chǎn)物；留尿測(cè)定24小時(shí)尿蛋白；取腎組織PAS染色觀察腎臟病理改變，應(yīng)用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜鑒定方法比較DM大鼠腎組織蛋白質(zhì)的差異表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.第24周時(shí)DM組大鼠FPG、HbA1c、AGEs水平與C組相比較均顯著升高；24h尿蛋白定量較C組大鼠增多。
　　 2.光鏡下PAS染色顯示，與C組比較，DM組大鼠腎小球ECM增多，系膜細(xì)胞增生，同時(shí)毛細(xì)血管部分塌陷，腎小囊部分粘連。
　　 3.

9、雙相電泳及質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)的DM大鼠腎組織的差異表達(dá)蛋白25個(gè)，其中上調(diào)點(diǎn)13個(gè)，下調(diào)點(diǎn)12個(gè)，其生物功能包括物質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡和熱休克等。
　　 4.25個(gè)差異表達(dá)的蛋白中GSTM在DM組表達(dá)較C組上調(diào)。Westen Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DM組大鼠腎組織GSTM的表達(dá)也較C組顯著增高，與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：
　　 1.蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是研究DN的發(fā)病機(jī)制和治療的新靶點(diǎn)

10、的有效方法；我們利用雙相電泳及質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)的DM大鼠腎組織的差異表達(dá)蛋白25個(gè)，其中上調(diào)點(diǎn)13個(gè)，下調(diào)點(diǎn)12個(gè)，其生物功能包括物質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡和熱休克等，這些差異表達(dá)的蛋白可能參與DN的發(fā)病。
　　 2.對(duì)兩組大鼠腎組織GSTM的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)DM組大鼠腎組織GSTM的表達(dá)較C組增高，提示GSTM可能在DN的發(fā)病中起一定的作用，我們將在今后工作中做進(jìn)一步深入的研究。
　　 第

11、二部分高糖誘導(dǎo)大鼠系膜細(xì)胞GSTM的表達(dá)及干預(yù)治療的實(shí)驗(yàn)研究
　　 研究背景和目的：
　　 系膜細(xì)胞是腎臟固有細(xì)胞之一，具有多種生理功能，在病理情況下，MC與其他腎臟組織細(xì)胞一樣，不但是疾病的受害者，而且也是直接的參與者。它能通過(guò)自身細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)分化，通過(guò)產(chǎn)生各種致炎、致纖維化物質(zhì)而影響疾病的進(jìn)程。事實(shí)上，MC增生及系膜硬化是最為常見(jiàn)的對(duì)各種腎小球損傷的反應(yīng)。利用體外培養(yǎng)的MC進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)研究，對(duì)深入了解腎臟的生理及

12、病理生理的變化，了解各種腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制具有十分重要的作用。
　　 DN在組織學(xué)上的特征性改變包括腎小球基底膜增厚和系膜基質(zhì)合成增多，而系膜基質(zhì)合成增多主要是由MC產(chǎn)生增多。久而久之，腎臟出現(xiàn)腎小球硬化，相應(yīng)的腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維化，可見(jiàn)MC在DN的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。
　　 由于以上原因，我們選擇了體外培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞，研究高糖刺激下GSTM在RMC的表達(dá)情況及抗氧化劑白藜蘆醇干預(yù)治療的意義，以期了解GSTM

13、在DN發(fā)病中的作用。
　　 材料和方法：
　　 常規(guī)體外培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞，分為5組：①正常對(duì)照組(C組)；②高糖組(HG組)；③高糖+2.5μM白藜蘆醇組(T1組)；④高糖+5μM白藜蘆醇組(T2組)；⑤高糖+10μM白藜蘆醇組(T3組)。治療組相應(yīng)濃度白藜蘆醇預(yù)孵育1h，在高糖條件下培養(yǎng)48h，應(yīng)用MTT比色法和CCK8法測(cè)定系膜細(xì)胞增殖。收集細(xì)胞用流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，PI染色法檢測(cè)

14、細(xì)胞周期； Westen Blot檢測(cè)系膜細(xì)胞GSTM和Nrf2的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.MTT比色法測(cè)定HG組較C組RMC增殖率增高，Res治療后T2、T3組增殖率較HG組減低，T1組增殖率較HG組減低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CCK8法測(cè)定HG組增殖率較C組增高，Res治療后T1、T2、T3組均較HG組增殖率減低，且三個(gè)治療組間增殖率有差異，隨Res濃度增加增殖率降低。
　　 2.HG組G1期細(xì)胞比例較C組增

15、高(P＜0.05)，Res治療后T3組G1期細(xì)胞比例較HG組減少(P＜0.05)，而T1、T2組G1期細(xì)胞比例雖較HG組減少，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。HG組S期細(xì)胞比例較C組減少(P＜0.01)，Res治療后T2、T3組S期細(xì)胞比例較HG組增高(P＜0.01)。三個(gè)治療組間T2、T3兩組S期細(xì)胞比例較T1組增高(P＜0.05)，T2與T3組之間無(wú)差別(P＞0.05)。各組間G2期細(xì)胞比例無(wú)差異(P＞0.05)。
　　 3

16、.HG組細(xì)胞凋亡率與C組無(wú)差別(P＞0.05)，Res治療后T2、T3組凋亡率較HG組增加(P＜0.01)，T1組凋亡率雖較HG組增高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 4.HG組GSTM表達(dá)較C組增高(P＜0.001)，Res治療后T2、T3組GSTM表達(dá)較HG組減低(P＜0.01)，T1組GSTM表達(dá)較HG組減低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。三個(gè)治療組之間GSTM表達(dá)均有差異(P＜0.05)，隨Res濃度增加GST

17、M表達(dá)減少。
　　 5.HG組Nrf2表達(dá)較C組增高(P＜0.001)，Res治療后T2、T3組Nrf2表達(dá)較HG組減低(P＜0.01，P＜0.001)，T1組Nrf2表達(dá)較HG組減低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。三個(gè)治療組之間Nrf2表達(dá)有差異(P＜0.05)，隨Res濃度增加Nrf2表達(dá)減少。
　　 結(jié)論：
　　 1.在高糖刺激下，系膜細(xì)胞GSTM表達(dá)上調(diào)，這可能是DM大鼠腎組織GSTM表達(dá)上調(diào)的原因之一

18、。
　　 2.Res干預(yù)治療高糖刺激下的RMC，下調(diào)GSTM表達(dá)對(duì)RMC起保護(hù)作用。Res下調(diào)系膜細(xì)胞GSTM表達(dá)是通過(guò)調(diào)節(jié)上游基因Nrf2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
　　 3.Res能抑制高糖誘導(dǎo)的RMC增殖，且抑制作用存在一定的量效依賴(lài)關(guān)系。
　　 (1)Res抑制RMC的增殖與影響RMC的細(xì)胞周期有關(guān)。Res能抑制RMC從S期進(jìn)入G2/M期，將RMC阻滯于S期，對(duì)高糖誘導(dǎo)的RMC增殖起抑制作用。
　　 (2)誘