鉤端螺旋體主要屬特異性蛋白抗原定位及其免疫性研究.pdf

1、問號(hào)鉤端螺旋體(Leptospira interrogans)(簡稱鉤體)感染引起的鉤端螺旋體病(Leptospirosis)是全世界范圍內(nèi)廣泛流行的自然疫源性人獸共患病，尤其多見于水稻種植地區(qū)，因而我國是鉤體病的主要疫區(qū)之一。問號(hào)鉤體自然宿主眾多，并可在宿主腎臟長期生存、繁殖并隨尿液排出，污染土壤和水源，人類通過接觸疫土和疫水而感染，故鉤體病是各國洪澇災(zāi)害時(shí)重點(diǎn)防疫和監(jiān)控的傳染病之一。 接種疫苗是預(yù)防和控制鉤體病流行最有效的措

2、施。但鉤體血清群眾多，各群間交叉保護(hù)作用較弱或無，不同地區(qū)優(yōu)勢(shì)鉤體血清群、型可有明顯差異，故目前國內(nèi)外均采用當(dāng)?shù)亓餍械闹饕^體血清群、型來制備多價(jià)全菌死疫苗。多價(jià)鉤體全菌死疫苗副作用較大，且對(duì)其未包含的其它鉤體血清群感染保護(hù)作用極其有限。由我國學(xué)者研制的國際上首個(gè)鉤體組分疫苗——多價(jià)外膜疫苗，雖有免疫效果好、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，但仍無對(duì)不同鉤體血清群的交叉免疫保護(hù)力。因此，尋找鉤體屬特異性保護(hù)抗原，進(jìn)而研制出對(duì)不同血清群有廣泛免疫交叉保護(hù)作

3、用的通用型鉤體基因工程疫苗，對(duì)預(yù)防和控制鉤體病具有重要意義。 Shang、Haake和Cullen等先后分別從問號(hào)鉤體基因組DNA中克隆了全長819 bp、編碼272個(gè)氨基酸的lipL32基因、全長1068 bp、編碼355個(gè)氨基酸脂蛋白的lipL41基因，全長1014bp、編碼337個(gè)氨基酸的ompl1基因和全長561bp、編碼186個(gè)氨基酸的lipL21基因并認(rèn)為上述基因存在于所有問號(hào)鉤體菌株中。我們以往的研究結(jié)果證實(shí)，我國

4、15群15型致病性問號(hào)鉤體參考標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA中均可擴(kuò)增出上述全長基因片段，但分別存在lipL32/1和lipL32/2、lipL41/1和lipL41/2、ompl1/1、ompl1/2和ompl1/3基因型。其中l(wèi)ipL32/1和lipL41/1基因型包含了我國所有主要流行的鉤端螺旋體血清群，如黃疸出血群、流感傷寒群、賽羅群、波摩那群、七日熱群、秋季群和犬群等，而含有ompL1/3基因型的鉤體血清群引起人類鉤體病極為罕見，因此不作

5、為此次研究的對(duì)象。 由于保存不當(dāng)，lipL41/2原核表達(dá)系統(tǒng)丟失，為了確保實(shí)驗(yàn)的完整性，本研究重新構(gòu)建了lipL41/2原核表達(dá)系統(tǒng)，其它原核表達(dá)系統(tǒng)由浙江大學(xué)病原生物教研室提供。IPTG誘導(dǎo)rLipL21、rLipL32/1和rLipL32/2、rLipL41/1和rLip41/2、rOmpL1/1和rOmpL1/2表達(dá)，采用Ni-NTA親和層析法，提取了四種鉤體外膜蛋白主要基因型重組表達(dá)產(chǎn)物。SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白的

6、表達(dá)和純化結(jié)果。采用鹽變法提取了我國15群15型問號(hào)鉤體參考標(biāo)準(zhǔn)株及非致病的雙曲鉤體Patoc Ⅰ株的外膜蛋白。以相應(yīng)兔抗血清為一抗，采用Western Blot檢測(cè)上述4種外膜蛋白自然表達(dá)情況及其免疫反應(yīng)性。建立了基于rLipL21、rLipL32s、rLipL41s、rOmpL1s的ELJSAs，檢測(cè)鉤體病人血清中相應(yīng)特異性抗體水平及其類型。采用膠體金免疫電鏡技術(shù)，對(duì)上述蛋白進(jìn)行膜定位。研究發(fā)現(xiàn)rLipL21、rLipL32/1和r

7、LipL32/2、rLipL41/1和rLipL41/2、rOmpL1/1和rOmpL1/2表達(dá)量分別約占細(xì)菌總蛋白的10％、40％和35％、15％和10％、30％和15％，各重組蛋白SDS-PAGE提純后均僅見單一的蛋白條帶。重組蛋白兔抗血清在同一基因不同基因型表達(dá)產(chǎn)物之間有廣泛的交叉免疫反應(yīng)性。各血清群鉤體外膜中均可檢出上述四種外膜蛋白，但LipL21僅存在于問號(hào)鉤體中。LipL21、LdpL32、LipL41、OmpL1均為鉤體屬

8、特異性表面抗原，可作為通用性鉤體疫苗及檢測(cè)試劑盒的候選抗原。不同稀釋度的156例鉤體病人血清標(biāo)本中，rLApL21特異性IgM陽性率分別為69.9％(109/156，血清標(biāo)本1：50稀釋)和63.5％(99/156，血清標(biāo)本1：100稀釋)，特異性IgG陽性率為均為99.4％(155/156)。rLipL32/1和rLipL32/2、rLipL41/1和rLipL41/2、rOmpL1/1和rOmpL1/2特異性IgM陽性率分別為91.

9、3％～92.9％、90.4％～92.2％、84.6％～87.8％、78.2％～83.3％、67.9％～79.5％和75.0％～75.6％；特異性IgG陽性率分別為99.4％～99.4％、97.4％～98.1％、69.2％～81.4、75.0％～80.1％、71.8％～79.5、75.0％～76.9％。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，LipL21、LipL32s、LipL41s、OmpL1s是位于鉤體表面屬特異性蛋白抗原。自然感染鉤體時(shí)，上述蛋白均可誘

10、導(dǎo)機(jī)體體液免疫應(yīng)答并產(chǎn)生IgM和IgG兩類血清抗體，且每種基因的不同基因型之間有廣泛的抗原交叉反應(yīng)。 我們的Western Blot結(jié)果顯示，所有目的重組蛋白兔抗血清均能與16株鉤體外膜蛋白(OEP)制品中某一蛋白條帶發(fā)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，其位置與lipL32/1、lipL32/2、lipL41/1、lipL41/2、ompL1/1和ompL1/2基因表達(dá)產(chǎn)物分子量相符。與MAT結(jié)果相似，即上述基因表達(dá)產(chǎn)物是存在于鉤體表面、具有良

11、好免疫反應(yīng)性的屬特異性蛋白抗原。其中IJpL21條帶著色最弱，提示其表達(dá)量可能較其它蛋白為低。LipL32/1條帶略濃于LipL32/2、LipL41/1、LipL41/2、OmpL1/1、OmpL1/2，且該基因型幾乎包括了我國流行最廣的鉤體血清群如黃疸出血群、犬群、致熱群、秋季群、澳州群、波摩那群、流感傷寒群和七日熱群，以及巴達(dá)維亞群、賽羅群、明尼群，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)rLipL32/1表達(dá)產(chǎn)量最高，提示rLipL32/1應(yīng)是研制鉤體

12、通用性疫苗及檢測(cè)試劑盒的首選抗原。LipL41/1、LipL41/2、OmpL1/1和OmpL1/2條帶無明顯差異，但lipL41/1基因型所包含的鉤體血清群與lipL32/1基因型幾乎完全相同；但rOmpL1/1和rOmpL1/2表達(dá)量高于rLipL41/1和rLipL41/2。因此，rLipL41/1、rLipLA1/2、rOmpL1/1、rOmpL1/2作為疫苗及檢測(cè)試劑盒候選抗原各有優(yōu)劣，故若研制多價(jià)抗原基因工程疫苗或檢測(cè)試劑盒