乳中IgA和IgM含量的變化及其影響因素的機(jī)理研究.pdf

1、本試驗(yàn)由四部分組成，主要研究了初乳、常乳和免疫乳血清和乳清中各免疫球蛋白含量的變化規(guī)律及其乳清中主要蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析，并研究了牛乳中IeA和IgM濃度的影響因素，包括奶牛胎次、泌乳階段、產(chǎn)奶量、體細(xì)胞評(píng)分(SCS)以及奶牛plgR基因5'側(cè)翼區(qū)的SNP。以小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物模型來(lái)探討奶牛乳腺中IgA和IgM合成轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)理，研究了小鼠免疫刺激后plgR基因的表達(dá)量及與特異性lgA含量的相關(guān)性。具體研究結(jié)果如下： 試驗(yàn)一：采

2、用埋植抗原緩釋劑ARD這一種新型的免疫乳生產(chǎn)技術(shù)。選取2胎牛20頭，按照泌乳天數(shù)、產(chǎn)奶量相近的原則隨機(jī)分成2組，每組10頭，其中10頭用于埋植ARD(試驗(yàn)組)，其余為對(duì)照(對(duì)照組)。采集每頭牛的乳樣和血樣。同時(shí)采集奶牛產(chǎn)后0-7 d的初乳乳樣(n=20)和產(chǎn)后1 d和5 d的血樣。采用夾心ELISA測(cè)定血清和乳清中的免疫球蛋白IgG、IgA和IgM的含量。結(jié)果表明免疫組奶牛的血清和乳清中的各免疫球蛋白的含量均高于對(duì)照組。其中乳清中IgG

3、的含量在9 d、17 d和32 d分別達(dá)到最高峰，這與ARD在埋植后0 d、14 d和28 d釋放相一致。相反，乳清中的IgA和IgM的含量沒有表現(xiàn)出相同的規(guī)律。初乳牛1d的血清中IgM的含量顯著高于5 d的含量(p<0.05)，而IgG和IgA的含量無(wú)顯著差異。初乳乳清的各免疫球蛋白含量隨著泌乳天數(shù)的增加而迅速下降，直至維持在較低的水平。SDS-PAGE結(jié)果表明，從電泳圖譜上可以清晰的看見5個(gè)條帶，自上而下依次是乳鐵蛋白、牛血清白蛋白

4、、IgG重鏈、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。其中32 d的免疫乳和0-3 d的初乳可以看到IgG的輕鏈，其它樣品IgG輕鏈條帶較弱。0-7d初乳各乳清蛋白的相對(duì)含量隨著泌乳天數(shù)增加而逐漸下降，在0-5d內(nèi)差異顯著(p<0.05)，直至維持在較低水平。免疫乳15 d和32 d各乳清蛋白均高于常乳。 試驗(yàn)二：研究了正常泌乳奶牛中IgA和IeM的濃度是否受奶牛胎次、泌乳階段、產(chǎn)奶量和牛奶體細(xì)胞評(píng)分(SCS)的影響。從1600多頭奶牛群體

5、中隨機(jī)選擇284頭奶牛采集其牛奶樣品，通過夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定其IgA和IgM的濃度。牛奶中IgA和IgM的濃度(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，對(duì)數(shù)形式，下同)分別為2.371±0.286和1.499±±0.383。4胎以上(含4胎)的奶牛其乳中IgA平均濃度高于1胎、2胎和3胎牛，而3胎牛和4胎牛其乳中IgM的平均濃度差異顯著(p<0.05)；IgA濃度在泌乳前期和泌乳中期較低，而IgM濃度隨著泌乳天數(shù)的增加而增加；產(chǎn)奶量為20-2

6、5kg和大于30 kg的奶牛其乳中IgA含量較低，但是產(chǎn)奶量并不影響IgM含量；牛奶中IgA和IgM含量都隨著SCS的增加而增加。相關(guān)分析和通徑分析表明，這些因素對(duì)牛奶中IgA和IgM的累積效應(yīng)值分別達(dá)到了0.320和0.358。 試驗(yàn)三：從NCBI上的Map Viewer數(shù)據(jù)庫(kù)下載牛plgR基因的5'側(cè)翼區(qū)的序列(Nw 174143)，長(zhǎng)度為3.2 kb，設(shè)計(jì)4對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過對(duì)25頭牛的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序發(fā)現(xiàn)SNP

7、位點(diǎn)，采用SNP Stream標(biāo)簽微列陣基因分型系統(tǒng)對(duì)189頭牛進(jìn)行基因分型，將其與牛奶和血液中的IgA和IgM的含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，在基因-3128、-3072、-2834、-2348和-515位發(fā)現(xiàn)了5個(gè)SNP位點(diǎn)，其中SNPl和SNP2為A/G突變，SNP3、SNP4和SNP5為T/C突變。方差分析結(jié)果表明，SNP1對(duì)牛奶IgM和血液IgA含量有顯著的影響(p<0.05)，SNP3和SNP5對(duì)血液IgM含量有顯著影響(p<

8、0.05)，其它SNP位點(diǎn)與單倍型組合對(duì)乳及血液中IgA和IgM的含量均沒有顯著影響(p<0.05)；多重比較分析表明，SNP1位點(diǎn)的基因型AB個(gè)體與BB個(gè)體的牛奶IgM和血液IgA含量的最小二乘均數(shù)差異顯著(p<0.05)；SNP3和SNP5的不同基因型對(duì)血液IgM含量的最小二乘均數(shù)分別達(dá)到了顯著水平(p<0.05)。因此，從研究結(jié)果可以看出奶牛okgR基因5'側(cè)翼區(qū)的多態(tài)性影響牛奶和血液中的IgA和IgM的含量，這為進(jìn)一步研究牛奶中

9、IgA和IgM分泌轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理提供了一定的理論依據(jù)。 試驗(yàn)四：本試驗(yàn)以小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)研究乳中IgA的產(chǎn)生轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理。選擇48只健康昆明小白鼠，分為A、B、C、D組，分別于分娩后第4d注射以下四種疫苗：滅菌生理鹽水、Lipase+滅菌生理鹽水、空ISCOM和Lipase+ISCOM，每組注射12只，并于分娩后8 d和12 d(即注射后4 d和8 d)采集各小鼠乳樣、血樣和乳腺組織，用間接ELISA法測(cè)定乳樣和血漿中的特異性IgA含量，

10、用Real TimePCR檢測(cè)小鼠乳腺中pIgR基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，血漿中特異性IgA的含量差異不顯著，而B組和D組中分娩后12 d的乳中特異性IgA含量顯著高于8 d乳中的特異性IgA含量(p<0.05)，Real Time PCR相對(duì)定量結(jié)果也表明，B組和D組在分娩后12 d的乳腺中pIgR基因的表達(dá)量上升。因此，乳腺中pIgR基因表達(dá)量增加可以提高乳中特異性IgA的水平，這表明pIgR參與介導(dǎo)IgA跨膜分泌進(jìn)入乳中，pIg