山羊毛色稀釋位點候選基因MLPH研究.pdf

1、本試驗根據(jù)GenBank上已發(fā)表的牛(NC_007301)和狗(NC_06607)的melanophilin基因序列進(jìn)行設(shè)計引物，擴(kuò)增山羊melanophilin基因的從部分內(nèi)含子1至外顯子16序列片斷(在內(nèi)含子2和內(nèi)含子9中由于特殊序列結(jié)構(gòu)分別有兩個估計12.5KB和7KB的缺口沒有測通)，測序總長度為19289bp，已提交到GenBank，序列號為EU316218。為比較不同物種MLPH基因分化程度，也同時測定了綿羊MLPH基因相應(yīng)

2、序列，序列號為:EU316219。 根據(jù)測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)了山羊melanophilin基因序列上的76個點突變，其中處于外顯子的有18個，內(nèi)含子的58個。依據(jù)序列號EU316218上的位置來命名這些突變位點，處于外顯子上的18個點突變分別為2486A>C、5620A>G、8731C>G、8743G>A、8753G>A、8765C>T、8782C>T、11512G>A、11584G>A、13998G>A、14012A>G、17308T

3、>C、18904A>G、18927G>T、1895lA>G、18929T>C、18955A>C、和18977A>G其中引起蛋白質(zhì)的氨基酸序列的改變的點突變共有6個，分別是Ala8731Gly、Arg8743His、Pr08782Leu、Aspll512Asn、Glyll584Ser以及Lysl4012Arg。處于內(nèi)含子的58個點突變分別為1468G>T、2260G>A、2517G＞A、5644C>T、7935T>C、7958C>T，79

4、72G>A、8067G>C、8068C>T、8151G>A、8242G>A、8580T>A、8587C>A、8610G>A、8645＞T、9109G>A、93851＞A、8892T>A、8923C>G、9009G>A、9125G>A、9179G>C、9613T>C、9656A>C、l0028A>G、9918C>T、10745G>T、10831C>T、10515C>T、10813C>T、10925T>G、11362G>A、11395A>G

5、、11421T>C、11832C>A、13542T>C、13774A>C、13782C>G、13797A>G、13898A>C、14992G>A、15144G>A、15146A>G、15592T>C、15897T>C、17041C>T、17078TC、16710＞A、16711C>A、16761G>A、16878G>A、17041C>T、17047T>C、17078T>C、17200C>A、17885C>T、18634T>A、和1874

6、0C>T。 研究發(fā)現(xiàn)在melanophilin基因的8580T＞A 、8587C>A、8610G＞A、8645C>T、8731C>G、8743G>A、8753G>A、8765C>T和8782＞T九個點突變位點呈現(xiàn)完全連鎖現(xiàn)象。并且在我們測序的108個山羊個體中，野生純和個體為92個，雜合個體16個，所以推測該連鎖位點可能為隱性致死基因。且該位點突變率在雷州黑山羊中分布最高，為38.46％。 11584G>A位點上檢測到G

7、和A兩個等位基因。我們研究的9個山羊品種304個個體中A為優(yōu)勢等位基因(83.88％)，突變率在不同品種中存在差異，分析表明，成都麻羊突變率最高(39.58％)，其次為南江黃羊(在快長系、高繁系和黑色系中分別為29.41％、27.14％和26.53％)。剩余的幾個品種中，除了承德無角山羊突變率為13.89％其余四個品種，包括濟(jì)寧青山羊、雷州山羊、遼寧絨山羊和唐山奶山羊中，突變率都不足2％。并且GG基因型只在成都麻羊和南江黃羊三個品系中出

8、現(xiàn)，所以等位基因G可能為隱性，且與南江黃羊和成都麻羊特征性的麻褐色有關(guān)。 在獲得的山羊序列的3’UTR區(qū)，發(fā)現(xiàn)罕見的poly(A)加尾信號AATAAG，我們比較了不同物種的加尾信號。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其他基因中高度保守的AATAAA，對于MLPH基因只在人、大猩猩、小鼠和挪威鼠中發(fā)現(xiàn)，另外一個單堿基突變體AATGAA在牛和負(fù)鼠中發(fā)現(xiàn)。然而某些物種中，找不倒一個合適的六核苷聚體可以認(rèn)為是加尾信號或其變異體?？赡茉从贛LPH:基因較高的突變

9、率，或者在MLPH基因的表達(dá)過程中有其不同于其他基因的方式。 對于終止密碼子，大部分物種使用TAA，包括山羊、綿羊、牛、馬、豬、人、大猩猩和小鼠。三個物種使用TGA，包括貓(正常的和提前終止的)，狗和挪威鼠。TAG作為終止密碼子只在負(fù)鼠和雞中發(fā)現(xiàn)。氨基酸序列長度在物種間變異很大，從鴨嘴獸的487aa到雞的617aa，平均長度577.7aa，標(biāo)準(zhǔn)偏差34.6aa。對于偶蹄動物，變化從豬的577aa到綿羊610aa。通過對4個偶蹄動

10、物的序列比對，發(fā)現(xiàn)在綿羊193到196位有4個氨基酸殘基(QPQP)的插入，在237到262位有26個殘基插入(SLDWKDPHSKELPVPSETCRPFPCAQ)。在豬中發(fā)現(xiàn)兩個缺失，一個為6個氨基酸殘基(QEAGIL)位于249位之后，另一個為384位之后一個殘基E缺失，這兩個缺失片段在其他三個偶蹄動物中為100％一致。 總體來說，MLPH基因變異度很大，以牛的氨基酸序列為參考，于其他物種的氨基酸一致性分別為山羊90.82

11、％、綿羊88.52％、馬66.39％、貓64.10％、狗64.02％、豬69.69％、人59.61％、大猩猩55.03％、小鼠、53.97％、挪威鼠53.50％、負(fù)鼠28.20％、鴨嘴獸34.67％和雞39.37％。 對于不同物種間mRNA序列，在山羊、綿羊和其他11個哺乳動物中，總體平均遺傳距離(p-distance模型)和標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.447和0.014。當(dāng)用不同物種間的氨基酸序列重新計算這些數(shù)值時，結(jié)果變大。哺乳動物間的

12、總平均為0.523，標(biāo)準(zhǔn)差0.025。用軟件Mega3.1中UPGMA法計算得到的分歧指數(shù)檢測矩陣見表3.6。當(dāng)換用相應(yīng)的氨基酸序列重新計算該矩陣，原來91個達(dá)到P<0.05的配對檢驗中只剩下38個，大都也在原來91個之中。以上兩種參數(shù)比較都說明MLPH基因在物種間氨基酸序列的變異要大于mRNA的變異，表明在進(jìn)化過程中MLPH基因在編碼區(qū)的同義突變較之錯義突變要少許多。 另外,EST作為cDNA的隨機(jī)測序結(jié)果，對研究組織的基因表

13、達(dá)有重要意義，本文對來自山羊來自帶毛囊的皮膚和乳腺兩種組織的EST序列進(jìn)行了綜合及分類分析，結(jié)果顯示，在來源于絨山羊含毛囊皮膚的392條EST序列中有48條為編碼角蛋白或角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白的基因；在乳腺來源的245條EST中則無此類基因，而是如免疫球蛋白基因、維生素轉(zhuǎn)運蛋白基因、MHC等諸多種類基因，以免疫和酶類居多。兩類不同組織來源的EST相應(yīng)基因相似之處最顯著的是編碼核糖體蛋白的基因，其中含毛囊皮膚組織的ESI中有15.1％，乳腺組織為