山羊抗胃腸道線蟲(GINs)感染候選基因篩選及效應(yīng)研究.pdf

1、胃腸道線蟲(GINs)是影響小型反芻動物經(jīng)濟的重要寄生蟲之一，也是世界上許多地區(qū)動物健康問題的主要來源。該寄生蟲感染的抗性或易感性與遺傳因素有關(guān)，且在品種與品種之間、個體與個體之間有差異。了解抗GINs感染的遺傳機制對于有效和可持續(xù)地控制胃腸道線蟲感染是十分重要的。然而，宿主對GINs感染的反應(yīng)的分子機制目前尚不十分清楚。本研究對山羊GINs感染的候選基因、通路、特異性抗體反應(yīng)及可能的機制進(jìn)行了研究。
　　(1)通過糞便蟲卵計數(shù)法

2、篩選鑒定了宜昌白山羊(YWGs)品種內(nèi)的抗性和易感個體。對選擇的山羊檢測寄生蟲學(xué)參數(shù)和血液學(xué)參數(shù)，并由感染試驗和轉(zhuǎn)錄組分析來對抗性組和易感組的的GINs感染情況進(jìn)行分析。同時評估局部mIgA和系統(tǒng)性sIgE對GINs感染過程中的特異性抗原的保護機制和調(diào)節(jié)活性。本研究中共有來自不同地點的384只山羊用于鑒定ATP2A3基因中的單核苷酸多態(tài)性和它們與GINs感染性狀的相關(guān)性。現(xiàn)場試驗結(jié)果表明，抗性組較易感組的蟲卵量及蟲卵產(chǎn)生均有降低。與抗性

3、山羊相比，易感山羊的血液學(xué)參數(shù)在觀察期間的，血紅蛋白（Hgb）有顯著降低(p＜0.01)，填充細(xì)胞容積(PCV)百分比較低(p＜0.05)，同時發(fā)現(xiàn)易感的山羊血紅蛋白低于正常血紅蛋白值（90-150g/L）。線蟲感染試驗后，抗性組山羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲數(shù)量顯著低于易感組山羊(p＜0.05)。在本研究的三個性狀中，糞便蟲卵計數(shù)(FEC)與血紅蛋白呈負(fù)相關(guān)(r=-0.94)，糞便蟲卵計數(shù)(FEC)與填充細(xì)胞容積呈負(fù)相關(guān)（r=-0.90），其中血紅

4、蛋白與填充細(xì)胞容積呈正相關(guān)(r=0.94)。
　　(2)在GINs感染抗性組和易感組中各選擇四個極端個體，進(jìn)行血液轉(zhuǎn)錄組分析以比較其mRNA表達(dá)譜。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，兩組共有顯著差異(p＜0.001)表達(dá)的基因2369個，其中上調(diào)基因1407個，下調(diào)基因962個。在抗性組中高表達(dá)的298個基因的功能注釋產(chǎn)生了46個顯著的(p＜0.05)功能注釋簇，包括涉及免疫生物合成過程以及一些與免疫系統(tǒng)相關(guān)的途徑的31個基因（先天免疫9個，獲得性

5、13個，先天免疫9個），如轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β，促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和細(xì)胞粘附分子(CAMs)。這些發(fā)現(xiàn)提供了與改善宿主對GINs感染的抗性相關(guān)的認(rèn)識，并為進(jìn)一步了解山羊?qū)INs感染抗性機制打下了基礎(chǔ)。
　　(3)從轉(zhuǎn)錄組分析得到的差異表達(dá)基因中選擇12個上調(diào)和下調(diào)的基因，通過qRT-PCR來進(jìn)行驗證。在選擇的基因中，與抗性組山羊相比，6個上調(diào)基因（ITGA4，C3，BCL2，ATP7A，ERAP1和ST6GA

6、P1）在易感山羊中高表達(dá)，另外6個下調(diào)基因（LST1，IFI44L，IL1R2，F(xiàn)12，CCL27和IFI6）在易感山羊中低表達(dá)。ITGA4，C3，BCL2，ST6GAL1，LST1，IFI44L，IL1R2和IFI6基因在p＜0.01水平顯著差異表達(dá)，ATP7A，ERAP1，F(xiàn)12和CCL27在p＜0.05水平顯著差異表達(dá)，同轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果相一致。將qRT-PCR log2表達(dá)（倍數(shù)變化）數(shù)據(jù)和mRNA序列l(wèi)og2表達(dá)（倍數(shù)變化）數(shù)據(jù)

7、擬合在線圖和表達(dá)模式中，相關(guān)系數(shù)為0.912，線性回歸模型為Y=0.839X-2.252，與測序表達(dá)結(jié)果呈顯著的相關(guān)性。
　　(4)局部粘膜免疫球蛋白-A(mIgA)和全身性血清免疫球蛋白-E(sIgE)是針對GINs感染的最重要的應(yīng)答抗體。本研究調(diào)查了局部mIgA和系統(tǒng)性sIgE，監(jiān)測了局部mIgA和系統(tǒng)sIgE針對特定抗原的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)兩者與GINs感染的成年期、生殖力和蟲體長度呈負(fù)相關(guān)，表明其調(diào)節(jié)抗寄生蟲感染方面的作用。

8、>　　(5)應(yīng)用qRT-PCR在山羊中檢測了5個感染相關(guān)基因的相對情況，結(jié)果表明，在易感山羊中C3，LTBP2，ABCB1和SMAD3基因的表達(dá)水平較高，但I(xiàn)L1R2基因在抗性山羊中高表達(dá)。皺胃組織（胃底和幽門組織），淋巴結(jié)（胃腸和腸系膜）和小腸組織中的C3和IL1R2基因的mRNA相對表達(dá)譜顯示出顯著差異，而基因LTBP2，ABCB1和SMAD3在易感山羊和抗性山的淋巴結(jié)和小腸組織中沒有顯示出差異?？傮w來說，抗原特異性局部mIgA和全

9、身sIgE以及組織特異性應(yīng)答，特別是C3和IL1R2應(yīng)答，在山羊GINs感染的遺傳抗性機制中具有重要效應(yīng)。
　　(6)檢測了ATP2A3基因的多態(tài)性，并研究了其與三個中國山羊群體中GINs感染的關(guān)系。在山羊ATP2A3基因中發(fā)現(xiàn)了7個新的變異，其中5個位于3'UTR區(qū)域，2個位于外顯子區(qū)且為同義突變。7個變異的基因型和等位基因頻率與Hardy-Weinberg平衡及群體遺傳學(xué)參數(shù)相一致，如多態(tài)性信息量(PIC)在恩施黑山羊、南江黃

10、羊及宜昌白山羊中分別為0.26，0.32和1.54，雜合度(He)在恩施黑山羊、南江黃羊及宜昌白山羊中分別為0.28，0.35和1.60，有效等位基因數(shù)(Ne)在恩施黑山羊、南江黃羊及宜昌白山羊中分別為0.28，0.34和1.55。
　　(7)關(guān)聯(lián)分析顯示，在7個多態(tài)性位點中有4個多態(tài)性位點對山羊GINs感染有顯著影響。從7個單核苷酸多態(tài)性的單倍型和LD結(jié)構(gòu)來看，3'非編碼區(qū)C24361893T和C24379974T以及3'UTR

11、區(qū)的C24358400A和G24358441C兩對變異體之間存在顯著的連鎖不平衡，及較高的連鎖不平衡系數(shù)(D')，并分別跨越了18.081kb(～18kb)和0.041kb(～0kb)的兩個區(qū)域。從ATP2A3基因的4個多態(tài)性位點及其單倍型組合中，從這4個突變構(gòu)建了8個以前未發(fā)現(xiàn)的單倍型，其中AG和CC單倍型頻率最高，分別為65.0％和53.3％，其次是其他單倍型。通過qRT-PCR分析，ATP2A3基因的mRNA的相對表達(dá)量在易感山羊