EGCG對慢性紫外線輻射光損傷的干預(yù)作用和不同劑型模型藥物透皮分布的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景日光中的紫外線(UV)，主要為長波紫外線(UVA)和中波紫外線(UVB)，UVA主要作用于真皮，其深度可達(dá)真皮中部，成纖維細(xì)胞是其作用的主要靶部位，UVA輻射主要引起氧化應(yīng)激，誘發(fā)產(chǎn)生活性氧類物質(zhì)(Reactiveoxygenspecies，ROS)。UVB部分可達(dá)真皮淺層，成纖維細(xì)胞是其靶部位之一，UVB輻射可引起活性氧類物質(zhì)的產(chǎn)生、局部和系統(tǒng)性的免疫抑制，但最主要是被皮膚細(xì)胞DNA吸收而直接引起DNA損傷。 綠茶提取

2、物茶多酚中的主要活性成分沒食子兒茶素沒食子酸脂(epigallocatechingallate，EGCG)有著廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，如抗過氧化及抗腫瘤等作用。 UV單次輻射引起的急性光損傷，往往引起細(xì)胞增殖減慢、凋亡增加，光加合物嘧啶二聚體形成，急性大劑量照射甚至可以導(dǎo)致DNA突變及皮膚癌發(fā)生。加入EGCG干預(yù)，可以減少急性光損傷所引起的細(xì)胞增殖減慢、凋亡增加，減少光加合物嘧啶二聚體形成，減輕損傷，下調(diào)p53等抑癌基因的表達(dá)。但對慢

3、性UV輻射所導(dǎo)致的細(xì)胞增殖、突變、凋亡、老化，以及加入EGCG后的干預(yù)作用目前研究甚少。 可以MTT法研究UV輻射后的細(xì)胞增殖情況?？捎每寺》▉頇z測細(xì)胞HPRT基因位點(diǎn)突變頻率，從而判斷UV輻射或者干預(yù)因素對于細(xì)胞的致突變力。 可用流式細(xì)胞儀檢測UV輻射后凋亡及細(xì)胞周期變化情況。細(xì)胞周期包括G0/G1、S和G2/M期，當(dāng)受到外界損傷性刺激是，細(xì)胞DNA合成與分裂時(shí)間延長，細(xì)胞大量停滯在G0/G1、S和G2/M期，為修復(fù)D

4、NA損傷贏得時(shí)間，創(chuàng)造條件。 UV輻射后的細(xì)胞老化情況有很多指標(biāo)可以反映，其中衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-Gal)最具代表性且檢測方便。在老化的細(xì)胞中，SA-β-Gal表達(dá)升高。近來研究顯示機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞衰老也是一種重要的抗腫瘤防衛(wèi)機(jī)制，衰老反應(yīng)是一種避免細(xì)胞發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)化的安全控制機(jī)制。 本研究所涉及的中藥單體EGCG為一種水溶性物質(zhì)，為了將其

5、更好的運(yùn)用于臨床皮膚病的預(yù)防及治療，開發(fā)研制一種合適的劑型是非常必要的。脂質(zhì)體是由脂質(zhì)雙分子層組成的多層囊泡，有生物膜的特性和功能，本身可生物降解，無毒性，無皮膚刺激性，具有親水性和疏水性，可以促進(jìn)水溶性或難溶藥物的經(jīng)皮吸收。當(dāng)前，載藥脂質(zhì)體在皮膚病治療中的應(yīng)用越來越受到重視。但其與傳統(tǒng)劑型如溶液、乳劑的區(qū)別和優(yōu)勢并不是很清楚。熒光素鈉(NaFl)具有熒光特性故可示蹤并可通過熒光分光光度計(jì)予以定量，因其為一種可溶性物質(zhì)，故我們將它選為水

6、溶性藥物的模型藥物。 本項(xiàng)目旨在研究慢性UV輻射對培養(yǎng)狀態(tài)下人皮膚成纖維細(xì)胞的HPRT基因位點(diǎn)突變頻率、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期變化、細(xì)胞老化比率的影響以及加入EGCG后的干預(yù)作用和不同劑型模型藥物的透皮分布情況，籍此可為天然防曬劑的開發(fā)和實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)參考。 目的觀察長波和中波紫外線日常劑量慢性照射對培養(yǎng)狀態(tài)下人皮膚成纖維細(xì)胞的次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)基因位點(diǎn)突變頻率、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期和細(xì)胞老

7、化比率的影響以及EGCG的干預(yù)作用；觀察以熒光素鈉為水溶性藥物的模型藥物，在溶液、脂質(zhì)體和乳劑(O/W)制劑狀態(tài)下對人體皮膚透皮性能和在皮膚分布的影響，籍此可為天然防曬劑的開發(fā)和實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)參考。 方法1.細(xì)胞培養(yǎng)：分離獲得新生兒包皮環(huán)切術(shù)后皮膚成纖維細(xì)胞，在37℃、5﹪CO2。條件下培養(yǎng)于含10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌謩e定量接種在6孔板以及100mm培養(yǎng)皿中備用。2.藥物配置：以DME

8、M培養(yǎng)液配制EGCG，貯存液濃度500μg/ml，分裝貯存于-20℃冰箱，EGCG的實(shí)驗(yàn)終濃度為25μg/ml。 3.實(shí)驗(yàn)分組：成纖維細(xì)胞培養(yǎng)48h后，分為6組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，包括空白對照組、EGCG組、慢性UVB(290～320nm)輻射組、慢性UVB+EGCG組、慢性UVA(320～400nm)輻射組、慢性UVA+EGCG組。 4.紫外線照射：根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)定時(shí)定量分別予UVA或UVB照射培養(yǎng)細(xì)胞并預(yù)先加入相關(guān)藥物

9、5.HPRT基因位點(diǎn)突變頻率檢測：克隆法檢測各組細(xì)胞HPRT基因位點(diǎn)突變頻率。 6.細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期檢測：收集各組細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測成纖維細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期改變。 7.細(xì)胞老化檢測：SA-β-Gal組織化學(xué)染色法檢測細(xì)胞老化。 8.NaFl模型藥制備：以超聲波法制備成0.125﹪NaFl脂質(zhì)體混懸液(A劑型)，常規(guī)方法制備0.125﹪NaFl溶液(B劑型)和0.125﹪NaFl乳劑(C劑型)(O/W)。

10、 9.透皮實(shí)驗(yàn)：用離體人皮進(jìn)行水溶性模型藥物三種劑型的體外透皮實(shí)驗(yàn)。 10.模型藥物透皮分布的觀察：熒光顯微鏡觀察待測皮膚制成的組織病理切片，分析模型藥物的分布情況。 11.模型藥物累積透過量以及在皮膚各層貯留量的檢測：用熒光分光光度計(jì)分別檢測2h～12h接收池和表皮、真皮淺層、真皮深層中模型藥物的熒光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算模型藥物貯留在接收池和皮膚各層的濃度。 結(jié)果1.日常劑量UV慢性輻射后可上調(diào)人皮膚成纖

11、維細(xì)胞的HPRT基因位點(diǎn)突變頻率，加入EGCG可顯著下調(diào)HPRT基因位點(diǎn)突變頻率。在未經(jīng)照射的正常細(xì)胞中，自發(fā)突變率很低，慢性UVB及慢性UVA照射誘導(dǎo)的突變分別是未經(jīng)照射的自發(fā)突變的72倍及241倍，而經(jīng)EGCG處理的UVB+EGCG組和UVA+EGCG組突變頻率顯著低于單純UVB和單純UVA照射組，分別較單純UVB組和單純UVA組降低了52.78﹪和32.37﹪。 2.日常劑量UV慢性輻射后可上調(diào)人皮膚成纖維細(xì)胞的凋亡率，加

12、入EGCG可進(jìn)一步上調(diào)其凋亡率，使細(xì)胞大量停滯于G0/G1期和G2/M期。空白對照組及EGCG組均未見明顯的凋亡峰。慢性UVA輻射組和慢性UVB輻射組較空白對照組細(xì)胞凋亡率分別增加了33倍和43.22倍，S期細(xì)胞增多，慢性UVB輻射組的細(xì)胞凋亡率較慢性UVA輻射組增加了30.06﹪；而經(jīng)EGCG處理的UVB+EGCG組和UVA+EGCG組凋亡率則明顯上升，兩組分別與單純UVB組和單純UVA組比較細(xì)胞凋亡率分別增加了87.08﹪和56.9

13、2﹪，且G0/G1及G2/M期細(xì)胞增多，EGCG+慢性UVB照射組較其單純照射組凋亡率增高幅度大于EGCG+慢性UVA照射組較其單純照射組，其中P值均＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.EGCG可減緩生理代謝狀態(tài)下的人皮膚成纖維細(xì)胞老化，在未經(jīng)照光實(shí)驗(yàn)組中，正常細(xì)胞與EGCG共培養(yǎng)80天后，EGCG組的β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞數(shù)較空白對照組下降了47.60﹪(P＜0.05)，可見加入EGCG可在一定程度上減緩自然代謝過程的細(xì)胞老

14、化。 日常劑量UV慢性輻射后可上調(diào)人皮膚成纖維細(xì)胞的老化概率，加入EGCG可進(jìn)一步上調(diào)其老化概率。在受試細(xì)胞為經(jīng)慢性UV干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)16天的正常細(xì)胞組及與正常細(xì)胞共培養(yǎng)的EGCG組均只見少量的β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞。其余幾組陽性細(xì)胞比率為：慢性UVB組＜慢性UVA組＜EGCG+慢性UVB組＜EGCG+慢性UVA組，4組細(xì)胞間陽性比率經(jīng)單因素方差檢驗(yàn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。4.溶液劑型和脂質(zhì)體劑型的模型藥物累積透皮

15、量相對較小，乳劑組的藥物透皮量顯著高于其他兩組。脂質(zhì)體劑型的模型藥物始終濃集在表皮層，溶液劑型的模型藥物基本只停留在角質(zhì)層，只有12h后藥物深至真皮層，乳劑的模型藥物自表皮至真皮的濃度始終顯著高于其他兩種劑型。 結(jié)論慢性照射日常劑量UVA，其損傷性高于UVB。EGCG可以降低日常生理劑量UV慢性照射引起的HPRT基因位點(diǎn)突變頻率，上調(diào)日常生理劑量UV慢性照射引起的細(xì)胞凋亡頻率及老化概率，提示EGCG可能可以減少突變細(xì)胞，降低皮膚

16、癌癥的發(fā)生，這可能是通過誘導(dǎo)不可逆損傷細(xì)胞的老化及凋亡而達(dá)到的。為了促進(jìn)EGCG的臨床應(yīng)用而設(shè)計(jì)的不同劑型模型藥物透皮實(shí)驗(yàn)顯示：皮膚外用制劑中脂質(zhì)體包裹水溶性藥物可在人皮膚表皮層保持較高濃度，真皮貯留量和累積透皮量小，故適用于病變存在于表皮的皮膚病以及那些透皮吸收后有副作用的藥物。乳劑由于其表皮真皮藥物分布量及皮膚透過量均較其他兩種劑型高，故適用于有效濃度低及透皮吸收后副作用小的藥物。溶液劑型適用于角質(zhì)層剝脫的皮膚病以及透皮吸收后副作用