海洋細(xì)菌來(lái)源的新型糖胺聚糖降解酶的篩選、鑒定與應(yīng)用.pdf

1、糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）又稱(chēng)為粘多糖，是由重復(fù)單位組成的直鏈多糖。根據(jù)其二糖單位的不同，糖胺聚糖又被分為透明質(zhì)酸(Hyaluronic Acid，HA)，肝素/硫酸乙酰肝素（Heparin/Heparan Sulfate，Hep/HS），硫酸軟骨素/硫酸皮膚素(Chondroitin Sulfate/Dermatan Sulfate，CS/DS)，硫酸角質(zhì)素(Keratan Sulfate，KS)。糖胺聚糖

2、常常由于各種修飾酶的作用使糖鏈變得異常復(fù)雜，主要表現(xiàn)為D-葡萄糖醛酸在C5-差向異構(gòu)酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)-艾杜糖醛酸，糖鏈中不同部位羥基（-OH）和氨基(-NH2)的硫酸化，以及己糖胺二位氨基的乙?；取Ｌ前肪厶墙Y(jié)構(gòu)的復(fù)雜性賦予其功能的多樣性，不同的結(jié)構(gòu)具有不同的功能。
　　糖胺聚糖廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞表面和細(xì)胞基質(zhì)中，常常通過(guò)與各種蛋白的相互作用參與了細(xì)胞的增殖分化、細(xì)胞間的識(shí)別、細(xì)胞轉(zhuǎn)移、組織形態(tài)發(fā)生、癌變等各種生理和病理過(guò)程。糖

3、胺聚糖所具有的一系列重要的生物學(xué)功能使其成為重要的生物活性分子，在醫(yī)藥及功能食品中得到廣泛應(yīng)用，如肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸等。但由于糖胺聚糖結(jié)構(gòu)的不均一性，特別是硫酸化糖胺聚糖結(jié)構(gòu)的高度復(fù)雜性，使不同來(lái)源和不同批次的同一種糖胺聚糖在活性上存在很大差異。近年來(lái)的大量研究表明，糖胺聚糖的生物功能是通過(guò)多糖鏈中具有特殊結(jié)構(gòu)的功能區(qū)與特定蛋白的特異相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的，同一多糖鏈中存在不同結(jié)構(gòu)的功能區(qū)，與不同的蛋白相互作用可以行使不同的功能。因此

4、通過(guò)運(yùn)用底物特異性的糖胺聚糖內(nèi)切酶選擇性的部分降解糖胺聚糖多糖鏈，制備結(jié)構(gòu)均一或相對(duì)均一的特定功能區(qū)寡糖;通過(guò)運(yùn)用底物特異性糖胺聚糖硫酸酯酶可以對(duì)特性功能區(qū)寡糖進(jìn)行改造和修飾;通過(guò)綜合運(yùn)用底物特異性糖胺聚糖內(nèi)切酶和外切酶可以對(duì)特性功能區(qū)寡糖進(jìn)行測(cè)序。這些具有特異性的糖胺聚糖工具酶不僅在糖胺聚糖構(gòu)效關(guān)系研究和寡糖制備中具有重要作用，并且在神經(jīng)系統(tǒng)損傷治療中也有重要作用。但是目前可以利用的糖胺聚糖工具酶屈指可數(shù)，因此尋找新型糖胺聚糖工具酶對(duì)

5、于糖胺聚糖構(gòu)效關(guān)系研究具有重要作用。
　　海洋作為生命的起源，存在大量的生命形式。海洋中存在大量的結(jié)構(gòu)多樣的糖胺聚糖，但是之前并沒(méi)有相關(guān)糖胺聚糖降解酶的研究和報(bào)道。本論文以硫酸軟骨素為唯一碳源，在海泥中篩選出一株高效降解糖胺聚糖的菌株并進(jìn)行了基因測(cè)序。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了一系列新型糖胺聚糖工具酶基因，并對(duì)這些基因進(jìn)行了深入研究。主要研究成果包括以下幾個(gè)方面:
　　(a)糖胺聚糖降解菌的篩選:以鯊魚(yú)軟骨來(lái)源的硫酸軟骨素CS

6、-C為唯一碳源，從海泥中篩選得到15株多糖降解菌，其中編號(hào)為FC509的菌株表現(xiàn)為對(duì)褐藻膠、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、透明質(zhì)酸、肝素等多種多糖的降解和利用活性。因此本論文重點(diǎn)對(duì)FC509菌株進(jìn)行研究，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了一系列與糖胺聚糖降解利用相關(guān)的酶基因，并著重對(duì)其中的多個(gè)降解酶基因進(jìn)行了深入研究。
　　(b)內(nèi)切型糖胺聚糖裂解酶HCLase的相關(guān)研究:將HCLase基因構(gòu)建到大腸桿菌表達(dá)載體中異源表達(dá)

7、，并利用鎳柱進(jìn)行純化。底物降解實(shí)驗(yàn)表明:該酶具有高效降解HA和CS的活性，因此被命名為HCLase?；久笇W(xué)性質(zhì)研究表明:HCLase與已報(bào)道的糖胺聚糖降解酶不同，其具有嗜鹽特性，這與它來(lái)源于海洋細(xì)菌有關(guān)，切表現(xiàn)出良好的溫度和pH穩(wěn)定性。底物降解模式分析表明:HCLase是一個(gè)內(nèi)切型糖胺聚糖裂解酶，最小底物是4糖，最小產(chǎn)物是2糖。同時(shí)我們對(duì)HCLase不能降解的四糖進(jìn)行了序列測(cè)定，其結(jié)構(gòu)為A4,5HexUAα1-3GalNAc(6S)β

8、1-4GlcUA(2S)β1-3GalNAc(6S)，這個(gè)結(jié)果揭示CS糖鏈中葡萄糖醛酸二位羥基的硫酸化會(huì)抑制HCLase對(duì)糖苷鍵的有效切割。HCLase的最大的優(yōu)點(diǎn)是具有超高的酶活和良好的穩(wěn)定性，這些特性使其成為具有巨大應(yīng)用潛力的新型糖胺聚糖工具酶。
　　(c)外切型糖胺聚糖裂解酶HCDLase的相關(guān)研究:將HCDLase基因構(gòu)建到大腸桿菌表達(dá)載體pET30a中異源表達(dá)，并運(yùn)用親和層析柱對(duì)異源表達(dá)的酶進(jìn)行了純化。酶學(xué)性質(zhì)研究和底物

9、降解模式分析表明:該酶具有典型的外切型酶活性，可以從糖鏈的還原端有效降解HA、CS和DS，但不能降解Hep和HS，因此被命名為HCDLase。進(jìn)一步的研究表明:HCDLase可以降解還原端熒光標(biāo)記的硫酸化CS寡糖并產(chǎn)生二糖，但是不能降解熒光標(biāo)記的DS和HA寡糖，這說(shuō)明糖苷鍵類(lèi)型和硫酸化程度影響HCDLase的降解活性。最后我們運(yùn)用這種酶成功的對(duì)系列硫酸軟骨素六糖和八糖進(jìn)行了測(cè)序。上述一系列研究結(jié)果表明:HCDLase作為一個(gè)新型的外切型

10、糖胺聚糖裂解酶，在糖胺聚糖的構(gòu)效關(guān)系研究，特別是復(fù)雜CS功能寡糖測(cè)序中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
　　(d)新型內(nèi)切型糖胺聚糖硫酸酯酶4-O-Endosulfatase的相關(guān)研究:將該硫酸酯酶基因構(gòu)建到大腸桿菌表達(dá)載體pET30a中，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化?；久笇W(xué)性質(zhì)研究表明:該酶在最適反應(yīng)條件(30℃，pH8.0)下具表現(xiàn)出強(qiáng)的CS和DS硫酸酯酶活性;底物降解模式分析表明:該酶與已報(bào)道的CS/DS硫酸酯酶不同，不僅可以高效去除糖鏈