肝病相關(guān)血清糖胺聚糖生物標(biāo)志物的分析鑒定.pdf

1、糖胺聚糖在疾病中擔(dān)任重要角色,因此,血清中糖胺聚糖結(jié)構(gòu)、組成和含量的差異,可能是有用的診斷標(biāo)志物。本研究旨在分析糖胺聚糖及其二糖在多種慢性肝病患者血清中的含量,以尋找靈敏、特異性強的診斷標(biāo)志物。
　　本論文首先通過優(yōu)化酶解提取、陰離子交換層析、超濾離心脫鹽等技術(shù),建立了從血清中分離純化微量糖胺聚糖的方法,并適用于質(zhì)譜分析?？偨Y(jié)了9種硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸二糖的二級質(zhì)譜裂解規(guī)律,然后,利用二級質(zhì)譜結(jié)合所確定的特征碎片離子進行二糖的質(zhì)譜

2、定量,并和建立的AMAC-HP LC方法進行比較。以 AMAC-HP LC定量分析了多種生物樣本的硫酸軟骨素二糖組成;通過此研究方法的應(yīng)用,為進一步尋找新的疾病相關(guān)標(biāo)志物,以及疾病的早期診斷治療提供新的途徑。
　　本文內(nèi)容如下:
　　1.通過比較 DEAE-Cellulose、DEAE-52、DEAE-Sephacel離子交換填料和Vivapure Ion Exchange離心層析柱對糖胺聚糖的分離純化效果,確定采用Viva

3、pure Ion Exchange離心層析法,其回收率高(76.6％),穩(wěn)定性好,適用于微量糖胺聚糖的純化。
　　2.采用LC-ESI-QQQ方法初步分析了硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸的二糖結(jié)構(gòu),推測了二糖的裂解規(guī)律,并確定了各二糖的特征碎片離子,選擇豐度最高的特征碎片離子并優(yōu)化其MRM質(zhì)譜條件,以供定量分析。該方法根據(jù)二糖的硫酸化程度快速分離二糖,單次樣品可在10min內(nèi)完成分析。
　　3.以2-氨基吖啶酮(AMAC)作為熒光衍生

4、試劑,結(jié)合反相 HPLC方法,用于生物樣本中微量C S/HA二糖組成、定量分析,九種二糖可以實現(xiàn)基線分離,且多余的熒光試劑不影響二糖分析,省去柱前的純化過程,簡化了實驗步驟。該方法的檢出限為0.36ng,定量限為1.07 ng,精密度RSD<4.6%。以二糖混合標(biāo)準(zhǔn)品對AMAC-HPLC和LC-ESI-QQQ兩種定量方法的準(zhǔn)確性進行了比較,兩種方法均能準(zhǔn)確定量目標(biāo)組分,LC-ESI-QQQ方法前處理簡便快速,AMAC-HPLC可以獲得更

5、全面的二糖組成信息。
　　4.以 AMAC-HP LC方法分析了大鼠腦組織、大鼠血清、健康人血清和胎牛血清四種生物樣本的二糖組成,發(fā)現(xiàn)單硫酸根二糖4SCS總體含量較高,在大鼠腦組織、大鼠血清、健康人血清和胎牛血清四種樣本中分別占到43.8%,29.4%,69.7%和83.0%。0SCS在大鼠血清最高,為60.3%;人血清其次,為14.1%;胎牛血清含量最低,為5.5%。血清樣本中,高度硫酸化的CS二糖含量很低,三硫酸根二糖 Tri

6、 SCS未檢出,而大鼠腦組織中三硫酸根二糖 Tri SCS的含量占到了16.9%,三種雙硫酸根二糖SBCS、SECS、SDCS的含量分別為10.7%,8.8%和6.5%。血清和腦組織二糖組成差異較大;三種血清樣品的二糖組成相近但比例不同。
　　5.定量分析了健康、高血脂、非酒精性脂肪肝、肝硬化、肝癌患者,以及乳清酸誘導(dǎo)脂肪肝大鼠(Wistar)血清中的CS/HA二糖。同健康人血清組相比,發(fā)現(xiàn)肝硬化組和肝細(xì)胞癌組中的單硫酸根二糖4S

7、CS分別升高了(6%, P<0.05)和(7%, P<0.05);透明質(zhì)酸二糖0SHA分別升高(34.8%, P<0.05)和(36.3%, P<0.05)。與正常對照組相比,乳清酸模型組的軟骨素二糖0SCS顯著下降;與乳清酸模型組相比,海參皂苷組,脫硫皂苷組,皂苷苷元組及海星皂苷組的軟骨素二糖0SCS不同程度升高;乳清酸模型組的軟骨素二糖4SCS顯著高于正常對照組,根據(jù)上述結(jié)果,推測4SCS、0SHA和0SCS三種二糖是肝病的潛在分子