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文檔簡(jiǎn)介
1、人類子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎的接受性存在時(shí)間和空間的短暫性,即胚胎著床活動(dòng)受到“種植窗”的限制,“種植窗”的啟動(dòng)常常發(fā)生在內(nèi)源性黃體生成素(luteinizinghormone,LH)峰或使用外源性人絨毛促性腺激素(humanchorionicgonadotropin,hCG)(LH的類似物)或黃體酮的第4-5天,關(guān)閉發(fā)生在第9-10天。進(jìn)入到宮腔的胚胎和子宮內(nèi)膜按一定的時(shí)、空順序分泌相關(guān)蛋白或/和局部因子從而達(dá)到相互識(shí)別、相互融合完成著床過(guò)程。
2、胚胎著床過(guò)程的限速步驟是胚胎發(fā)育與子宮內(nèi)膜向接受態(tài)轉(zhuǎn)化過(guò)程同步。而LH峰是促進(jìn)卵子成熟、胚胎發(fā)育和子宮內(nèi)膜向接受態(tài)同步轉(zhuǎn)化的、最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因素。 如何評(píng)估胚胎發(fā)育與子宮內(nèi)膜向接受態(tài)同步轉(zhuǎn)化是預(yù)測(cè)胚胎著床成功與否的重要指標(biāo)。 現(xiàn)行評(píng)估胚胎發(fā)育潛能的方法包括胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分和生化指標(biāo)檢測(cè)。然而胚胎評(píng)分與胚胎發(fā)育潛能并不完全正相關(guān);胚胎分泌的細(xì)胞因子和蛋白類物質(zhì)參與自身發(fā)育調(diào)節(jié)和胚胎著床過(guò)程,被預(yù)測(cè)可能用來(lái)衡量胚胎發(fā)育潛能的標(biāo)志
3、物。本論文將在我們前期工作基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行人類卵母細(xì)胞和種植前胚胎LH表達(dá)的研究,為探討LH在人類卵子和胚胎發(fā)育過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 上個(gè)世紀(jì)五十年代開(kāi)始,學(xué)者們就從組織形態(tài)學(xué)、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、局部因子表達(dá)及其類固醇激素的調(diào)節(jié)作用等層次對(duì)子宮內(nèi)膜胚胎接受性的評(píng)價(jià)方面做了大量研究,提出上皮細(xì)胞吞飲泡(pinopod)、整合素αυβ3、白血病抑制因子(LIF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)部分地反映子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎的接受性
4、。但由于在胚胎移植周期子宮內(nèi)膜活檢取材的不現(xiàn)實(shí)性、被研究因子的獨(dú)立與局限、研究方法缺乏時(shí)、空連續(xù)性以及多因子表達(dá)的同期比較,其結(jié)果不足以真實(shí)地反映“種植窗”時(shí)期的標(biāo)志物,也不能解釋在子宮內(nèi)膜形態(tài)與功能轉(zhuǎn)化過(guò)程中局部因子的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系和調(diào)節(jié)機(jī)制。至今為止,還未能找到一種標(biāo)志物明確地用于臨床實(shí)踐評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎的接受性,選擇胚胎移植時(shí)機(jī)。 子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎接受性的功能改變是一個(gè)由多基因參與、連續(xù)動(dòng)態(tài)的復(fù)雜過(guò)程,不同功能的蛋白質(zhì)在時(shí)間與空
5、間上有序協(xié)同作用的結(jié)果。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)具有觀察多基因事件引起的蛋白質(zhì)組分整體變化、進(jìn)行時(shí)間與空間連續(xù)研究的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)為研究“種植窗”時(shí)期子宮內(nèi)膜蛋白質(zhì)表達(dá)的變化提供了優(yōu)良的技術(shù)平臺(tái)。 本論文采用熒光差異凝膠電泳(two-dimensionalfluorescencedifferencegelelectrophoresis,2D-DIGE)和基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assistedlaserdesorpti
6、on/ionizationtime-of-flightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)建立了正常生育能力婦女“種植窗”時(shí)期子宮內(nèi)膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究體系和蛋白質(zhì)表達(dá)譜,初步鑒定了32個(gè)差異表達(dá)蛋白,為進(jìn)一步篩選“種植窗”時(shí)期標(biāo)志蛋白,揭示子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎接受性調(diào)控的分子機(jī)制提供有力的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分黃體生成素在人類卵母細(xì)胞和種植前胚胎的表達(dá)研究目的:人類卵母細(xì)胞和種植前胚胎LH的表達(dá)。 研究
7、方法:采用免疫熒光標(biāo)記、激光共聚焦顯微鏡觀察體內(nèi)成熟和不成熟卵母細(xì)胞以及種植前胚胎LH的表達(dá)。 研究結(jié)果:1.人類卵母細(xì)胞和種植前胚胎均存在LH的表達(dá),表達(dá)強(qiáng)度隨胚胎發(fā)育加強(qiáng)。 2.體內(nèi)不成熟、成熟卵母細(xì)胞、2-8細(xì)胞階段的種植前胚胎LH主要分布在細(xì)胞膜,細(xì)胞連接處表達(dá)降低;桑葚胚、囊胚細(xì)胞膜和細(xì)胞漿同時(shí)存在LH表達(dá)。 3.多精受精和正常受精組、新鮮胚胎和凍融胚胎組LH表達(dá)率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 第二部分人類“
8、種植窗”時(shí)期子宮內(nèi)膜的蛋白質(zhì)表達(dá)研究研究目的:1.建立人類“種植窗”時(shí)期子宮內(nèi)膜蛋白2D-DIGE和MALDI-TOF-MS研究體系。 2.獲得正常生育婦女“種植窗”時(shí)期子宮內(nèi)膜蛋白質(zhì)2D-DIGE圖譜。 3.利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定差異蛋白,探討它們與“種植窗”的關(guān)系。 4.選取其中1-2個(gè)差異蛋白進(jìn)行“種植窗”時(shí)期在體子宮內(nèi)膜組織表達(dá)的定位和半定量驗(yàn)證。 研究方法:1.4例正常生育能力婦女志愿進(jìn)入本研究,采用
9、經(jīng)陰道超聲檢測(cè)卵泡發(fā)育,結(jié)合血、尿LH激素測(cè)定確定LH峰日。 2.通過(guò)組織微創(chuàng)活檢分別獲取“種植窗”前(LH+2天)和“種植窗”時(shí)期(LH+7天)的子宮內(nèi)膜組織樣本8份,每份樣本分為兩部分:一部分制備組織切片,行HE染色內(nèi)膜形態(tài)學(xué)檢查,采用免疫組化SP法檢測(cè)雌激素受體(estrogenreceptor,ER)、孕激素受體(progesteronereceptor,PR);另一部分經(jīng)純化、提取總蛋白樣品。 3.蛋白樣品Cy
10、dye染料標(biāo)記后進(jìn)行雙向電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE),經(jīng)不同波長(zhǎng)的激光掃描后,獲得2D-DIGE表達(dá)圖譜,使用DeCyder軟件分析,選取差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。 4.通過(guò)全自動(dòng)斑點(diǎn)處理工作站切點(diǎn)、酶解和點(diǎn)樣后,使用利用MALDI-TOF-MS進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定,并到本地NCBI、在線MASCOT蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證。 5.選擇差異表達(dá)蛋白—annexinA4應(yīng)用免疫組化SP
11、法進(jìn)行子宮內(nèi)膜組織表達(dá)的定位檢測(cè),westernblot行半定量分析。 研究結(jié)果:1.子宮內(nèi)膜組織時(shí)相LH+2天4例均為分泌早期,LH+7天4例均為分泌中期,兩組腺體與間質(zhì)ER/PR的陽(yáng)性率(92.5%±2.9%vs50.0%±21.6%;52.5%士26.3%vs37.5%±18.9%;88.8%士6.3%vs37.5%±32.0%;70.0%±21.6%vs62.5%±15.0%)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 2.0.1克子宮內(nèi)膜
12、組織可提取蛋白總量約為1480±420μg。 3.獲得“種植窗”子宮內(nèi)膜蛋白2D-DIGE圖譜,經(jīng)質(zhì)譜和數(shù)據(jù)庫(kù)分析鑒定差異蛋白32個(gè),其中17個(gè)上調(diào)表達(dá),15個(gè)下調(diào)表達(dá)。 4.AnnexinA4:LH+2天子宮內(nèi)膜上皮表達(dá),LH+7天子宮內(nèi)膜上皮和基質(zhì)均有表達(dá);Westernblot顯示LH+7天表達(dá)顯著增強(qiáng)。 結(jié)論:1.人類卵母細(xì)胞和種植前胚胎存在LH的時(shí)空表達(dá)。 2.建立人類“種植窗”時(shí)期子宮內(nèi)膜組織
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