高糖、高脂肪飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗大鼠肝細胞過氧化物酶體脂肪酸β-氧化的研究.pdf

1、目的：在高熱量低活動量的現(xiàn)代生活方式影響下，代謝性疾病糖尿病(DM)和糖耐量減低(IGT)的發(fā)病率不斷攀升。流行病學(xué)調(diào)查表明脂肪酸代謝紊亂與DM和IGT的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，表現(xiàn)為血漿游離脂肪酸水平升高。我們前期的研究[1]顯示主要是C22：0、C24：0等極長鏈脂肪酸水平明顯升高。動物實驗表明1型糖尿病(T1DM)和2型糖尿病(T2DM)動物模型體內(nèi)均存在過氧化物酶體功能改變，主要表現(xiàn)為過氧化氫酶、脂酰COA氧化酶和過氧化物酶體脂肪酸β

2、-氧化活性升高。大量的實驗研究[2]證實單純高脂飲食也可引起大鼠胰島素抵抗(IR)和血槳FFA水平升高，繼而出現(xiàn)IGT。然而高脂飲食對過氧化物酶體脂肪酸β-氧化相關(guān)酶活性的影響還了解不多，因此，本研究應(yīng)用高飽和脂肪酸(HSFA)、高不飽和脂肪酸(HUFA)和高糖(HS)飲食長期喂養(yǎng)正常成年Wistar大鼠，以了解不同飲食對大鼠肝臟過氧化物酶體脂肪酸β-氧化相關(guān)酶活性的影響有何不同，并進一步研究其可能存在的相關(guān)因素或可能機制。 方

3、法：1實驗動物模型的建立：清潔級健康成年雄性Wistar大鼠56只(購于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)，體重250-300g，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機分為四組，每組16只，對照組(NormalControlGroup，NC組)，高蔗糖組(HighsucroseGroup，HS組)，高飽和脂肪酸飲食組(HighsaturatedfattyacidGroup，HSFA組)、高不飽和脂肪酸飲食組(HighunsaturatedfattyacidGro

4、up，HUFA組)。正常對照組給基礎(chǔ)飼料，熱量組成為碳水化合物占65.5％，脂肪占10.3％，蛋白質(zhì)占24.2％；高糖飼料是在基礎(chǔ)飼料中添加20％蔗糖使碳水化合物熱卡占76.5％，脂肪熱卡占7％，蛋白質(zhì)熱卡占16.5％；高飽和脂肪酸飼料是在基礎(chǔ)飼料中添加20％牛油使飼料中碳水化合物熱卡占43％，脂肪熱卡占41％，蛋白質(zhì)熱卡占16％；高不飽和脂肪酸飼料是在基礎(chǔ)飼料中添加20％豆油配制而成，其熱卡比例同高飽和脂肪酸組。牛油中飽和脂肪酸含量6

5、9.1％，不飽和脂肪酸含量30.9％；豆油中不飽和脂肪酸含量84％，飽和脂肪酸含量16％；蔗糖純度99％。所有飼料均由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心配制。喂養(yǎng)24周。 2基礎(chǔ)指標的測定：每4周監(jiān)測大鼠體重，并經(jīng)心臟采血測空腹血糖(FBG)，血清甘油三酯(TG)，血清總膽固醇(TC)；測定血清FFA的含量。于24周每組隨機抽取6只大鼠做高胰島素-正葡萄糖鉗夾實驗；胰島素抵抗(IR)通過鉗夾試驗中葡萄糖輸注率(GIR)來評價。 3

6、標本的采集：每組取8只大鼠在麻醉狀態(tài)下，開腹迅速剪取肝臟組織，部分作為電鏡檢查標本，另一部分迅速放入冷鹽水漂洗后液氮冷凍，然后轉(zhuǎn)入負70攝氏度冰箱冷凍，用于過氧化氫酶、過氧化物酶體脂酰CoA氧化酶、過氧化物酶體脂肪酸β-氧化活性的測定。 4酶活性的測定：(1)過氧化氫酶活性的測定：采用分光光度法，在37℃，0.33％H2O2存在條件下，通過240nm波長處吸光度的降低來測定過氧化氫酶。分析條件下，每分鐘催化1umolH2O2分解

7、的酶量為1個酶活性單位；(2)過氧化物酶體脂肪酸β-氧化活性的測定：通過軟脂酰CoA氧化引起NAD+的還原，在340nm波長下來測定過氧化物酶體脂肪酸β-氧化活性，分析條件下，每分鐘還原1umolNAD所需的酶量為1個活性單位；(3)脂酰CoA氧化酶的測定：過氧化物酶體中脂酰CoA氧化生成H2O2的反應(yīng)與過氧化物酶催化高螢光物質(zhì)7-羥基-6-甲氧基香豆素(Scopoletin)氧化為非熒光物質(zhì)的反應(yīng)相偶聯(lián)。激發(fā)波長395nm，發(fā)射波長4

8、70nm.。根據(jù)樣本管和空白管的熒光差值查標準曲線，得出相應(yīng)的H2O2量，計算酶活性。分析條件下，每分鐘生成1umolH2O2所需的酶量為1個活性單位。 結(jié)果：1自12周后HSFA組、HUFA組大鼠體重與司期NC組比較具明顯增加，具有顯著性差異(p＜0.05或p＜0.01)，HS組體重增加不明顯，與同期NC組比較，沒有顯著性差異。24周時NC組、HS組、HUFA組、HSFA組體重較0周分別增加了25.3％、32.1％、37.4％

9、、35.7％。 2血生化指標：24周時，空腹胰島素、空腹血糖、血清總膽固醇、甘油三酯含量三個實驗組均高于對照組(p＜0.05或p＜0.01)，實驗組間無顯著差異(p＞0.05)，HSFA組血清總膽固醇和甘油三酯在4周時已有明顯升高，與其他組比較出現(xiàn)的時間最早，升高的值最大。HS組、HSFA組和HUFA組喂養(yǎng)第8周空腹胰島素及空腹血糖同時開始與NC有顯著性差異，一直延續(xù)到24周(p＜0.05或p＜0.01)，但三個實驗組間統(tǒng)計學(xué)差

10、別沒有顯著性(p＞0.05)。 3不同飲食喂養(yǎng)12周后，各實驗組游離脂肪酸(FFA)水平較NC組顯著升高(p均＜0.01)，HSFA組較HS組和HUFA組顯著升高(p均＜0.01)。24周時，各實驗組游離脂肪酸仍保持較高水平(p均＜0.01)，各實驗組間無顯著差異。 424周時，高胰島素-正葡萄糖鉗夾實驗顯示各實驗組葡萄糖的輸注率(GIR)顯著低于NC組(p＜0.01)，由低到高依次為HSFA組、HUFA組、HS組，HS

11、FA組與HUFA組顯著低于HS組(p＜0.01)。 524周時，各實驗組過氧化氫酶、過氧化物酶體脂酰CoA氧化酶、過氧化物酶體脂肪酸β-氧化活性升高。統(tǒng)計學(xué)分析：三個實驗組過氧化氫酶與對照組相比均有顯著性差異(p＜0.05)，HS組活性最高，其次為HSFA、HUFA組，三個實驗組之間無顯著性差異；三個實驗組過氧化物酶體脂酰CoA氧化酶活性與對照組相比均有顯著性差異(p＜0.01)，HSFA組最高，其次分別是HS組、HUFA組，三

12、個實驗組之間無顯著性差異。三個實驗組過氧化物酶體脂肪酸β-氧化活性與對照組相比均有顯著性差異(p＜0.05)，HUFA組最高，其次分別是HSFA組、HS組，三個實驗組之間無顯著性差異。 6電鏡顯示：肝細胞內(nèi)過氧化物酶體呈圓形或橢圓形。與對照組相比，三個實驗組大鼠肝細胞中過氧化物酶體數(shù)量明顯增多，單個過氧化物酶體體積增大，其中的核樣體電子密度降低；與對照組相比，三個實驗組肝細胞內(nèi)脂滴數(shù)量增多。 結(jié)論：1.經(jīng)高糖、不同脂肪酸