創(chuàng)傷后瘢痕形成機(jī)制及治療的研究.pdf

1、研究背景
　　 病理性瘢痕是創(chuàng)傷愈合后最常見的并發(fā)癥之一，一直是外科修復(fù)領(lǐng)域研究的難點(diǎn)與熱點(diǎn)。病理性瘢痕不但可以影響患者的容貌，而且產(chǎn)生的攣縮可導(dǎo)致不同程度的功能障礙，為該類患者后期治療帶來沉重經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。其形成機(jī)制及防治一直是醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。目前其形成機(jī)制仍不清楚，尚無療效確切的治療方法。
　　 多年來，眾多學(xué)者從不同角度探討增生性瘢痕的形成、消退機(jī)理，期望從中找到治療瘢痕的突破口。目前較一致的看法是:①增生性瘢

2、痕以細(xì)胞過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積為特征，其中成纖維細(xì)胞是主要的效應(yīng)細(xì)胞;②增生性瘢痕在生物學(xué)層面主要表現(xiàn)為膠原代謝紊亂;③TGF-β1/smad信號(hào)通路與成纖維細(xì)胞的增殖、分化、遷徙、凋亡及膠原代謝等多種生理、病理過程密切相關(guān)。
　　 成纖維細(xì)胞作為創(chuàng)傷愈合過程中的主要效應(yīng)細(xì)胞，常常表現(xiàn)為過度增殖和功能活躍，從而引起一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成創(chuàng)面修復(fù)失控，導(dǎo)致細(xì)胞外間質(zhì)的過多沉積和創(chuàng)傷的過度愈合，形成病理性瘢痕。由此可見，成纖維細(xì)

3、胞的功能異常在病理性瘢痕過度增生中扮演著重要的角色。Lekic等認(rèn)為它是創(chuàng)傷修復(fù)的工程師、建筑者和管理員。自Convey等于1959年培養(yǎng)瘢痕成纖維細(xì)胞獲得成功以來，開始了體外研究瘢痕的新階段，為從細(xì)胞水平上認(rèn)識(shí)瘢痕異常增生的機(jī)理提供了有力的證據(jù)和資料。近年來，病理性瘢痕的基礎(chǔ)研究不斷深入，成纖維細(xì)胞與瘢痕的關(guān)系以及瘢痕增生和侵襲性生長(zhǎng)機(jī)制已成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。但是，瘢痕成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)對(duì)于初學(xué)者仍較為困難，失敗率較高。因此，建立高

4、效的培養(yǎng)方法及對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞進(jìn)行鑒定及活力測(cè)定顯得尤為重要。
　　 目前普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為，增生性瘢痕的形成在生物學(xué)層面主要表現(xiàn)為膠原代謝紊亂。較多的研究表明在瘢痕增生過程中，膠原蛋白的大量合成和Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維比例發(fā)生變化是形成增生性瘢痕的重要機(jī)制。膠原代謝紊亂與MMPs、TIMPs間的動(dòng)態(tài)平衡以及TGF-β/smad信號(hào)通路的異常具有密切的關(guān)系。但是，目前關(guān)于膠原在增生性瘢痕組織中的變化及其調(diào)控機(jī)制仍不清晰，需進(jìn)一步澄清。

5、r>　　 MMPs和TIMPs間的動(dòng)態(tài)平衡是影響膠原代謝的重要因素。但是在創(chuàng)傷后增生性瘢痕組織中，膠原酶的變化說法不一。Ghahary等報(bào)道在體外培養(yǎng)的人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞間質(zhì)膠原酶mRNA表達(dá)水平明顯低于正常皮膚成纖維細(xì)胞，而兩者的金屬蛋白酶組織抑制因子表達(dá)無顯著差異。國(guó)內(nèi)趙燁德等研究證實(shí)MMP-3mRNA在HS組FB中表達(dá)水平低于正常組，而且降解DNP-多肽（膠原酶底物）能力也明顯降低;同時(shí)將MMP-3基因轉(zhuǎn)入HS成纖維細(xì)胞后，

6、提高了MMP-3表達(dá)水平，促進(jìn)了ECM降解，得出了類似的結(jié)果。同樣，在對(duì)皮膚異常瘢痕的研究中發(fā)現(xiàn)，異常瘢痕TIMP-1的表達(dá)明顯高于正常組織。在肝和腎的纖維化病變中也發(fā)現(xiàn)TIMP-1表達(dá)增加，可通過抑制MMPS的活性阻止過量的膠原降解。另外也存在較多與上述結(jié)果相反的報(bào)道。探索瘢痕組織內(nèi)MMPs和TIMPs的變化規(guī)律及其影響因素，可能為瘢痕形成機(jī)制提供線索。
　　 SMADs介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路在增生性瘢痕膠原代謝中發(fā)揮著重

7、要的作用。SMADs是信號(hào)從受體到核內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)主要轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，也是目前瘢痕增生研究最多、最為重要的信號(hào)分子。根據(jù)不同分型，對(duì)成纖維細(xì)胞具有雙向調(diào)控作用。目前大量研究已經(jīng)證實(shí)，其中Smad2/3是具有促進(jìn)作用的因子，而SAMD7是抑制性的中間作用分子。但是，由于分子內(nèi)部各種信號(hào)通路的相互作用，對(duì)于Smad2/3和SAMD7的變化規(guī)律及其影響因素仍是研究的重點(diǎn)。
　　 雖然大量的研究工作針對(duì)HS的發(fā)病機(jī)制和治療，并且取得了豐碩的成果，

8、但是對(duì)于增生性瘢痕的治療目前仍缺乏有效的方案。外科手術(shù)切除是增生性瘢痕最常用的治療。盡管各方面的改進(jìn)，如:“z”或“w”成形術(shù)局部減張，切除瘢痕的纖維部分，保留外層皮膚。但是，手術(shù)仍可能因愈合失控或再次創(chuàng)傷而導(dǎo)致瘢痕過量形成。本組因功能障礙及影響美觀，均采用手術(shù)的方法進(jìn)行治療。手術(shù)標(biāo)本用作本實(shí)驗(yàn)。大量的研究表明，燈盞花素可抑制纖維化病變進(jìn)展，燈盞花素是否能抑制病理性瘢痕成纖維細(xì)胞的增生，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。也有研究認(rèn)為細(xì)胞凋亡與HS的形成、

9、消退過程密切相關(guān)，通過調(diào)控成纖維細(xì)胞凋亡有望成為有效防治HS的新亮點(diǎn)。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過建立高效的瘢痕成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，觀察其生長(zhǎng)規(guī)律，并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)鑒定，首次探討燈盞花素對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響，希望尋找到有效治療增生性瘢痕的藥物。同時(shí)對(duì)瘢痕組織真皮層內(nèi)影響膠原纖維代謝相關(guān)分子進(jìn)行研究，挖掘其中重要分子的變化規(guī)律;為增生性瘢痕機(jī)制的闡明及治療提供思路。
　　 研究目的
　　 1、尋求一種高效的瘢

10、痕成纖維細(xì)胞體外原代培養(yǎng)方法。
　　 2、了解瘢痕成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)過程中的形態(tài)學(xué)變化和鑒定方法。
　　 3、了解病理性瘢痕組織形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)變化規(guī)律，更加深入地了解增生性瘢痕的形成機(jī)制。
　　 4、從細(xì)胞學(xué)方面初步探討燈盞花素對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及凋亡的影響，為尋找有效的天然藥物提供理論依據(jù)。
　　 研究方法
　　 1、標(biāo)本收集、
　　 收集標(biāo)本均來自來自廣東省第二人民醫(yī)院和廣州市紅

11、十字會(huì)醫(yī)院2011-06～2011-12創(chuàng)傷性瘢痕手術(shù)患者標(biāo)本24例，年齡18～56歲。標(biāo)本的獲取均征得患者的知情同意，并簽訂知情同意書。標(biāo)本入選和排除標(biāo)準(zhǔn):A、經(jīng)臨床醫(yī)生鑒定為瘢痕組織，并初步進(jìn)行分類（增生性、瘢痕疙瘩）;B、排除垂體、腎上腺疾病、傳染病、皮膚病及免疫性疾病患者，排除局部感染、潰瘍患者;C、手術(shù)前未接受針對(duì)瘢痕的任何治療。標(biāo)本的獲取均征得病人的同意，簽知情同意書。
　　 2、標(biāo)本的處理、分組
　　 組織

12、切取后冷凍干燥法保存，均于4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。標(biāo)本分三部分處理:一部分用于細(xì)胞原代培養(yǎng)，另一部分用10％福爾馬林甲醛溶液固定，用于形態(tài)學(xué)鑒定（如免疫組化等）;第三部分置于液氮中凍存?zhèn)溆茫ㄌ崛〉鞍缀蚏NA用于后續(xù)試驗(yàn)）。
　　 選取同期因其他手術(shù)切除的正常皮膚組織3例作為正常對(duì)照組進(jìn)行研究。
　　 3、組織微粒法進(jìn)行瘢痕成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)，總結(jié)和完善瘢痕成纖維培養(yǎng)的方法，并對(duì)建立的細(xì)胞系進(jìn)行命名和記錄相關(guān)資料;觀察瘢痕成纖維

13、細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律和生長(zhǎng)特點(diǎn)，MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖;根據(jù)細(xì)胞形態(tài)以及α-SMA抗體的細(xì)胞免疫組化對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　 4、對(duì)增生性瘢痕組織進(jìn)行HE染色和masson三色染色觀察其形態(tài)學(xué)特征，比較正常組織和瘢痕組織的差異性。
　　 5、CollagenⅠ，CollagenⅢ的免疫組織化學(xué)染色，分析其在瘢痕組織內(nèi)分布特點(diǎn)和表達(dá)量。
　　 6、應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)病理性瘢痕組織真皮內(nèi)CollagenⅠ

14、，CollagenⅢ，MMP-1，TIMP-1，SMAD3，SMAD7基因表達(dá)情況，并與正常組織進(jìn)行比較，分析其差異性;應(yīng)用WesternBlot技術(shù)檢測(cè)MMP-1、SMAD3、TIMP-1蛋白在瘢痕組織內(nèi)的表達(dá)。
　　 7、使用MTT法檢測(cè)不同濃度組瘢痕成纖維細(xì)胞增殖情況，繪制抑制率曲線圖，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組差異性;使用流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)不同濃度燈盞花素對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的影響:半定量RT-

15、PCR檢測(cè)細(xì)胞CollagenⅠ和CollagenⅢmRNA表達(dá)。
　　 研究結(jié)果
　　 1、瘢痕成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和鑒定
　　 (1)病理性瘢痕組織微粒在接種后大約2～7天，少量細(xì)胞從組織周圍放射狀或者旋渦狀爬出（圖1-1a、b）。原代成纖維細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出多個(gè)長(zhǎng)短不同的突起，多呈放射狀、編織狀或漩渦狀排列，有時(shí)細(xì)胞排列紊亂，有明顯的交叉重疊現(xiàn)象并呈團(tuán)塊狀。細(xì)胞免疫組化α-SMA染色顯示

16、細(xì)胞核呈類圓形或長(zhǎng)橢圓。
　　 (2)病理性瘢痕成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)，成纖維細(xì)胞剛接種尚未貼壁時(shí)呈球形(圖1-1c)，貼壁后細(xì)胞逐漸伸展,呈梭形、長(zhǎng)條形、多角形或不規(guī)則形(圖1-1d)。2～3d即呈匯合狀態(tài)(圖1-1e)。細(xì)胞密度低時(shí)細(xì)胞之間排列疏松，有較大細(xì)胞間隙（圖1-1e）。細(xì)胞密度高時(shí)，細(xì)胞相互平行排列或呈放射狀和漩渦狀排列(圖1-1f)。隨著細(xì)胞代齡的增高，細(xì)胞逐步出現(xiàn)老化現(xiàn)象，鏡下觀察可見細(xì)胞體積變大、形狀扁平，過度

17、伸展，伸展末端細(xì)長(zhǎng)有分支，生長(zhǎng)緩慢。
　　 (3)生長(zhǎng)曲線顯示:瘢痕成纖維細(xì)胞接種后經(jīng)過短暫的潛伏期，開始增長(zhǎng)的趨勢(shì)，于6～8天生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，10天以后進(jìn)入停滯期(圖1-3)。
　　 (4)α-SMA細(xì)胞免疫組化染色，出現(xiàn)較多陽性染色細(xì)胞的結(jié)果。結(jié)合其分離時(shí)的組織來源，以及其長(zhǎng)梭形、柵欄狀、漩渦狀生長(zhǎng)的特點(diǎn)，證實(shí)其為成纖維細(xì)胞。
　　 2、瘢痕組織HE染色觀察結(jié)果:(1)正常皮膚成纖維細(xì)胞和微血管數(shù)目較少(圖2

18、-3a)。(2)瘢痕組織內(nèi)可見成纖維細(xì)胞和微血管增多，微血管呈縮窄傾向（圖2-3e）。真皮內(nèi)見編織狀排列的大片致密嗜伊紅染同質(zhì)性粗大膠原纖維，排列紊亂，無一定的方向，膠原纖維相互交叉呈漩渦狀或結(jié)節(jié)狀分布，結(jié)節(jié)中的膠原纖維較細(xì)，各結(jié)節(jié)之間由粗大的膠原纖維束分隔，粗大的膠原纖維束間可見分布有數(shù)量不等的成纖維細(xì)胞和小血管。(3)瘢痕組織（圖2-3b、d）表皮厚度較正常表皮(圖2-3a)明顯增厚。
　　 3、Masson三色染色觀察發(fā)現(xiàn)

19、:瘢痕組織真皮層大量膠原纖維，粗細(xì)不一，顯示真皮乳頭層及附近血管增生，膠原纖維排列紊亂(圖2-4a);真皮網(wǎng)狀層膠原纖維排列致密，近表皮處紊亂，近皮下組織處排列規(guī)則，較多血管分布，部分膠原纖維交叉形成膠原結(jié)節(jié)，以近乳頭層處明顯（圖2-4b）。
　　 4、免疫組化結(jié)果（圖）顯示:瘢痕組織Ⅰ型膠原抗體在真皮層的細(xì)胞間質(zhì)中，主要分布于真皮網(wǎng)狀層，較為粗大，交織成結(jié)節(jié)狀，周圍散在分布成纖維細(xì)胞和血管壁。Ⅲ型膠原散在分布于真皮層的細(xì)胞間質(zhì)

20、中，以真皮乳頭層分布較多，膠原束較細(xì)，排列疏松，走行方向不一，互相交織。血管壁上均有兩種纖維的分布。
　　 5、RT-qPCR結(jié)果顯示:瘢痕真皮組織和正常皮膚真皮組織內(nèi)均可檢測(cè)到collagenⅠ、collagenⅢ、MMP-1、TIMP-1、SMAD3、SMAD7的基因表達(dá)。與正常組織相比，瘢痕組織內(nèi)collagenⅠ(t=5.85，P＜0.01)、collagenⅢ(t=4.515，P＜0.05)、MMP-1(t=-13.2

21、2,P＜0.01)、TIMP-1(t=2.52,P＜0.05)、smad7(t=-2.503,P＜0.05)基因表達(dá)差異具有顯著性;由圖可見collagenⅠ、collagenⅢ、TIMP-1表達(dá)較正常組織升高，而MMP-1表達(dá)較正常組織降低;Smad3(t=-0.339，P＞0.05)基因表達(dá)未見明顯差異。（圖2-7，表2-1）
　　 6、WesternBlot顯示:這些樣品中瘢痕真皮組織和正常皮膚真皮組織內(nèi)均可檢測(cè)到MMP-

22、1、TIMP-1、SMAD3蛋白表達(dá)，但是表達(dá)量均低于正常組織。(圖2-9)
　　 7、燈盞花素作用前后成纖維細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化;燈盞花素對(duì)體外培養(yǎng)FB生長(zhǎng)增殖具有明顯的抑制作用((F=3.309，P＜0.01)(表3-1)。與對(duì)照組相比，(80、100、150)μmol·mL-1濃度（實(shí)驗(yàn)）組明顯抑制瘢痕成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)(P＜0.05)。結(jié)合抑制率曲線可知，燈盞花素對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞的抑制作用呈劑量依賴性(圖1)。IC50=12

23、3.5μmol·mL-1。
　　 8、流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)FB凋亡結(jié)果顯示:IC50處瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡率為14.2050±0.95553，未加藥組瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡率為4.0220±0.31412，兩者相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-22.653，P＜0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示隨著燈盞花素濃度的升高，對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞collagenⅠ和collagenⅢmRNA產(chǎn)生明顯的影響，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(

24、如圖3-4，表3-1)
　　 結(jié)論
　　 1、本研究改良了瘢痕成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法，減少了培養(yǎng)失敗率，進(jìn)一步補(bǔ)充了瘢痕成纖維細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)理論，為細(xì)胞培養(yǎng)提供一種高效方法。
　　 2、瘢痕成纖維細(xì)胞和正常成纖維細(xì)胞形態(tài)上無明顯的區(qū)別，可利用特異性標(biāo)志α-SMA對(duì)其進(jìn)行鑒別。
　　 3、增生性瘢痕組織中collagenⅠ和collagenⅢ明顯的增加，MMPs表達(dá)減少，以及TIMPs表達(dá)增高，與創(chuàng)面愈合纖維瘢痕