農桿菌活體轉化技術的優(yōu)化與高抗草甘膦棉種質的創(chuàng)制.pdf

1、棉花是唯一可由種子生產纖維的農作物，棉花生產需要投入較多勞動力。由于勞動力的轉移，我國的人工價格不斷上漲，植棉的比較效益和經濟效益下降，導致近年我國棉花生產的連年滑坡。我國的棉花生產仍以人工作業(yè)為主，其中棉田除草是植棉用工的主要內容之一，占植棉用工的1/3以上。草甘膦(Glyphosate)是一種典型的廣譜性、內吸傳導型滅生性除草劑，是雜草控制的首選除草劑。本研究將具有自主知識產權的抗草甘膦除草劑基因(EPSPS-G6)構建進植物表達載

2、體，用農桿菌活體轉化方法將目的基因轉入陸地棉推廣品種中棉所49，創(chuàng)制高抗草甘膦棉花種質系，分析其抗性表現及相關農藝性狀，探討其生產應用前景。主要研究結果如下:
　　1、利用本實驗室構建的表達載體pCAMBIA1300-EPSPS-G6，酶切獲得目的基因EPSPS-G6，并與空載體pCAMBIA2301連接構建棉花高效表達載體——pCAMBIA2301-EPSPS-G6，去除原載體中的NPII篩選標記基因，將目的基因作為篩選標記。<

3、br>　　2、對本實驗室創(chuàng)制的農桿菌活體轉化方法進行優(yōu)化。結果表明，含50mg/L乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)的轉化液可將陽性率提高至22.18％，是對照(9.72％)的2.28倍。此外，不同轉化時間轉化效率差異顯著，其中開花當天中午12:00～14:00轉化得到陽性率最高(22.18％)，下午13:00～15:00次之(18.86％)，上午8:00～10:00轉化效率最低(11.29％)。
　　3、采用優(yōu)化的

4、農桿菌活體轉化方法，將EPSPS-G6基因導入到陸地棉推廣品種——中棉所49，共收獲轉化種子14.3 kg，T0轉化植株經20 mM草甘膦噴施，陽性率達22.18％。經PCR驗證，共獲得了35株含EPSPS-G6基且抗草甘膦的T0轉基因植株。
　　4、T1轉基因后代的抗性分離比例從1/4～3/4不等。對T1陽性植株進行自交，按單株收獲，T2抗性穩(wěn)定材料占19.8～32.1％，基本符合一對雜合基因分離的規(guī)律。
　　5、田間草甘

5、膦抗性水平和莽草酸含量結果表明，轉EPSPS-G6基因棉花種質系可抗3倍以上的推薦濃度，其抗性水平明顯優(yōu)于美國抗草甘膦品種和本實驗室創(chuàng)制的第一代抗草甘膦棉花種質系，其中EPSPSG6-501種質系抗草甘膦的能力最強。
　　6、轉EPSPS-G6基因棉花種質系籽棉產量、皮棉產量、衣分均與中棉所49近似;鈴重、籽指略高于對照;株高與對照近似;果枝數略低于對照;單株鈴數與對照一致。纖維品質檢測結果表明，轉EPSPS-G6基因棉花種質系的

6、纖維長度和整齊度略優(yōu)于對照;馬克隆值與對照在同一品級且略好于對照;伸長率略低于對照;斷裂比強度與對照相同。說明外源基因對于轉基因棉花種質系的產量、農藝性狀和纖維品質無明顯影響。
　　7、調查了金華地區(qū)的雜草發(fā)生情況與防控成本，為抗草甘膦棉花品種的應用提供依據。結果表明，金華地區(qū)棉田雜草以牛筋草、馬齒莧和小飛蓬為主，化學除草可節(jié)省植棉除草用工開支約1000元/畝，抗草甘膦棉花品種的生產應用可取得顯著的經濟效益，具有廣闊的生產應用前景