煙草根際鐵載體產(chǎn)生菌ARDRA分析、鐵載體拮抗活性研究及fur基因克隆.pdf

1、本研究對(duì)分離到的煙草根際鐵載體產(chǎn)生菌進(jìn)行了遺傳多樣性分析，從中篩選到一株限鐵條件下對(duì)煙草疫霉有較好拮抗作用的地中海假單胞菌，研究了其鐵載體對(duì)煙草疫霉的拮抗活性，克隆了其鐵吸收調(diào)控蛋白基因，并用轉(zhuǎn)座子誘變法獲得了其鐵載體合成缺失突變株，得出如下結(jié)論： 1、用16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性酶切分析(ARDRA)、16S rRNA序列同源性和進(jìn)化樹分析等方法，對(duì)從煙草根際分離到的299鐵載體產(chǎn)生細(xì)菌進(jìn)行了遺傳多樣性分析。這2

2、99個(gè)分離物分屬于28個(gè)ARDRA類型，由測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步可知分屬于β-，γ，α-變形桿菌、鞘氨醇桿菌、芽孢桿菌和放線菌綱的14個(gè)不同的屬。尤其是由假單胞菌、腸桿菌、沙雷氏菌、泛菌、歐文氏菌和窄食單胞菌構(gòu)成的丫-變形桿菌占據(jù)了18個(gè)ARDRA類型。研究結(jié)果展示了比以往研究更為豐富的鐵載體產(chǎn)生細(xì)菌多樣性，例如，首次報(bào)道了鞘氨醇桿菌G-2-21-1和G-2-27-2、Pseudomonas poae G-2-1-1、內(nèi)共生腸產(chǎn)氣桿菌G-2-1

3、0-2和N-5-10、食酸叢毛單胞菌G-1-15、木糖氧化無色桿菌N-46-11HH和N-5-20在限鐵條件下產(chǎn)生鐵載體。其中95％以上的鐵載體產(chǎn)生菌屬于革蘭氏陰性菌，枯草芽孢桿菌和紅平紅球菌是僅有的兩類革蘭氏陽性菌。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌和腸桿菌占了產(chǎn)生鐵載體總菌數(shù)的50％以上，還發(fā)現(xiàn)75％以上的產(chǎn)生高鐵載體活性單位(40～60)的細(xì)菌屬于假單胞菌。 2、從煙草根際篩選到一株限鐵條件下煙草疫霉[Phytophthora pa

4、rasiticavar.nicotianae(Breda de Hann)Tucker]拮抗菌G-229-21T。該菌產(chǎn)生高親和力鐵載體。通過形態(tài)特征、生理生化實(shí)驗(yàn)、16S rRNA序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析及種特異性分子法鑒定，確定其屬于Pseudomonasmediterranea。XAD-2吸附層析法提取其鐵載體，分光光度法檢測(cè)其產(chǎn)生羧酸型鐵載體。該鐵載體，在低鐵條件下(0.16 μmol/L～10μmol/L FeCl3)對(duì)煙草疫

5、霉的抑制率達(dá)92.3％以上，而在富鐵條件下(100 μmol/L FeCl3)抑制率僅為2.0％。 3、采用兼并引物PCR和TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR)法，獲得了完整的P. mediterranea G-229-21T鐵吸收調(diào)控蛋白基因序列。該基因與Pseudomonas fluorescens PfO-1 fur基因的同源性最高為82％，其編碼蛋白質(zhì)含有104個(gè)氨基酸，

6、與P. fluorescens PfO-1 Fur蛋白的同源性最高為86％。并通過Swiss-Model對(duì)其Fur蛋白空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行了模擬。 4、用抗生素平板法對(duì)P. mediterranea G-229-21T進(jìn)行抗藥性試驗(yàn)，G-229-21T對(duì)卡那霉素敏感，能夠耐受201μg/mL以上的氯霉素。利用轉(zhuǎn)座子Tn5-1063a對(duì)G-229-21T進(jìn)行轉(zhuǎn)座子插入誘變，篩選出1株鐵載體合成缺失突變株：G-229-21TA。用P. me