農(nóng)桿菌介導(dǎo)鐵載體基因IRT1轉(zhuǎn)化八棱海棠的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室原有八棱海棠再生體系的基礎(chǔ)上，采用了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將IRTI基因轉(zhuǎn)入八棱海棠中，獲得了4個(gè)攜帶IRTI基因的八棱海棠株系。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還初步探討了不同繼代次數(shù)對(duì)八棱海棠離體培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的影響。研究結(jié)果如下： 1.以離體培養(yǎng)不同繼代次數(shù)的八棱海棠的芽苗和幼葉為材料，來(lái)研究其對(duì)離體培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的影響。研究表明：隨繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加，繼代10次和48次的八棱海棠離體增殖倍數(shù)、生根能力、不定芽的再生頻率、每外植體再生芽數(shù)

2、和GUS基因瞬時(shí)表達(dá)率均顯著高于繼代5次的；繼代10次的增殖倍數(shù)和GUS陽(yáng)性率明顯多于繼代48次的，其它指標(biāo)相互間差異不顯著；說(shuō)明繼代10次的芽苗較適合用于八棱海棠離體培養(yǎng)的外殖體材料，其幼葉較適于遺傳轉(zhuǎn)化研究。 2.本研究在本實(shí)驗(yàn)室蘋(píng)果遺傳轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)上，通過(guò)研究?jī)煞N農(nóng)桿菌菌株LBA4404和GV3101、km對(duì)八棱海棠繼代苗的影響、km選擇壓的確定、Km加入時(shí)間、用加入頭孢的MSo清洗的時(shí)間及AS加入的方式對(duì)八棱海棠遺傳轉(zhuǎn)

3、化的影響，建立了八棱海棠簡(jiǎn)單、高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系：以LBA4404為侵染菌，加入75μmol/L AS的MS0活化菌株，剪取在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)35d的繼代苗的芽苗，再轉(zhuǎn)接在新的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)10d的葉片為實(shí)驗(yàn)材料，在加入AS的再生培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3d，用加入頭孢的MS0清洗共培養(yǎng)后的葉片10min，然后轉(zhuǎn)入延后培養(yǎng)基(MS+BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L+cb250mg/L)上培養(yǎng)3d，再轉(zhuǎn)到篩選培養(yǎng)基(MS+BA4.0mg/

4、L+NAA0.2mg/L+km25 mg/L+cb250mg/L)上，當(dāng)再生苗高2cm時(shí)，將苗轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)(MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+Km50mg/L)進(jìn)行選擇培養(yǎng)的遺傳轉(zhuǎn)化體系。 3.實(shí)驗(yàn)分別用兩種菌株同時(shí)侵染八棱海棠的葉片，兩種菌株AT126和AT96分別獲得了具有Km抗性的17個(gè)和7個(gè)株系，轉(zhuǎn)化率分別為6.58％和1.86％。通過(guò)生根檢測(cè)、GUS基因檢測(cè)、PCR擴(kuò)增以及RT-PCR檢測(cè)等方法表明，IR