轉(zhuǎn)rolC基因八棱海棠的獲得及其表達(dá)研究.pdf

1、八棱海棠(Malus robusta Rchd.)是目前我國(guó)使用最廣泛的蘋果喬化砧木，雖具有適應(yīng)性強(qiáng)、與蘋果品種親和力好等諸多優(yōu)點(diǎn)，但難以適應(yīng)現(xiàn)代化果樹(shù)矮化密植的要求。 rolC基因來(lái)源于發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒，其表達(dá)產(chǎn)物具有水解結(jié)合態(tài)細(xì)胞分裂素，釋放出自由態(tài)細(xì)胞分裂素，從而改變受體植物內(nèi)源激素平衡的作用。經(jīng)rolC基因轉(zhuǎn)化的受體植物，普遍植株矮化的形態(tài)學(xué)變化，因此，我們將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入八棱海棠基因紐，以期獲得矮化的蘋果砧木。

2、本文通過(guò)超聲波直接轉(zhuǎn)導(dǎo)法、超聲波輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將rolC基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入川麥海棠基因組，并通過(guò)PCR、Southern、RT-PCR和Northern等分子檢測(cè)技術(shù)對(duì)利用上述兩種方法以及本試驗(yàn)室利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法所獲得的轉(zhuǎn)rolC基因八棱海棠株系進(jìn)行了分子鑒定。對(duì)rolC基因利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法所獲得的3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)特征及其表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，研究結(jié)論如下： 1.應(yīng)用超聲波輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，對(duì)八棱海棠進(jìn)行，rolC基因轉(zhuǎn)化。利

3、用gus基因瞬間表達(dá)的方法研究了超聲波處理時(shí)間、處理時(shí)機(jī)和農(nóng)桿菌懸浮液中As濃度對(duì)rolC基因轉(zhuǎn)化率的影響。研究結(jié)果表明：葉盤在OD<,600>為0.6且含有75mg.L<'-1>As的農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡2分鐘后，用功率為100w的超聲波處理30秒，再浸泡2分30秒，然后放到的再生培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天，能獲得最佳的gus基因瞬間表達(dá)率。最佳處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)化683個(gè)八棱海棠葉片，共得到138個(gè)抗性愈傷組織和15株抗性苗，轉(zhuǎn)化率為2.2％。GU

4、S染色檢測(cè)結(jié)果顯示有12個(gè)八棱海棠株系的基因組中整合了完整的外源rolC基因。 2.應(yīng)用超聲波直接轉(zhuǎn)導(dǎo)法，對(duì)八棱海棠進(jìn)行rolC基因轉(zhuǎn)化。利用gus基因瞬間表達(dá)的方法研究了超聲波處理時(shí)間、處理功率和轉(zhuǎn)化緩沖液中DMS0濃度對(duì)rolC基因轉(zhuǎn)化率的影響。研究結(jié)果表明：當(dāng)DMS0濃度為5％時(shí)，用80w功率處理20分鐘，能夠獲得最佳的轉(zhuǎn)化效果。在超聲波最佳處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)化486個(gè)八棱海棠葉片，共得到237個(gè)抗性愈傷組織和9株抗性苗，轉(zhuǎn)化率

5、為1.85％。GUS染色檢測(cè)結(jié)果顯示，有8個(gè)八棱海棠株系的基因組中整合了完整的外源rolC基因。 3.對(duì)分別用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、超聲波輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和超聲波直接轉(zhuǎn)導(dǎo)法獲得的具有卡那霉素抗性并呈GUS陽(yáng)性的轉(zhuǎn)rolC基因蘋果砧木八棱海棠株系進(jìn)行分子鑒定和轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況鑒定。其中3個(gè)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的轉(zhuǎn)基因株系和12個(gè)超聲波輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得株系PCR檢測(cè)全部為陽(yáng)性，超聲波直接轉(zhuǎn)導(dǎo)法獲得的9個(gè)株系PCR檢測(cè)有8個(gè)呈陽(yáng)性。Sou

6、thern雜交結(jié)果顯示：3種方法轉(zhuǎn)化獲得的PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的23個(gè)株系均整合了完整的外源rolC基因。其中，2個(gè)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)基因株系獲得了至少1個(gè)拷貝，另外1個(gè)獲得了至少2個(gè)拷貝；7個(gè)超聲波輔助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因株系獲得了至少1個(gè)拷貝，3個(gè)獲得了至少2個(gè)拷貝，1個(gè)獲得了至少3個(gè)拷貝，1個(gè)獲得了至少4個(gè)拷貝；2個(gè)超聲波直接轉(zhuǎn)導(dǎo)法轉(zhuǎn)基因株系獲得至少2個(gè)拷貝，3個(gè)株系獲得了至少3個(gè)拷貝，2個(gè)株系獲得至少4個(gè)拷貝，另外1個(gè)獲得了至少6個(gè)拷貝。RT-

7、PCR檢測(cè)表明：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系在轉(zhuǎn)錄水平上均獲得表達(dá)；超聲波輔助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化12個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中的10個(gè)株系獲得表達(dá)；而超聲波直接轉(zhuǎn)導(dǎo)法8個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中僅有4個(gè)獲得表達(dá)。此外，對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的不同拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行Northern雜交表明：?jiǎn)慰截愔晗翟谵D(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)豐度高于雙拷貝株系。 4.在含有不同種類和濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上分別研究轉(zhuǎn)基因植株組培苗莖端增殖、葉片再生、生根等生物學(xué)特性；轉(zhuǎn)基因組培苗生物

8、學(xué)特性研究結(jié)果表明：(1)3個(gè)株系轉(zhuǎn)rolC基因八棱海棠莖端增殖、葉片再生、生根所需外源激素濃度均顯著低于對(duì)照植株，其中單拷貝株系顯著低于雙拷貝株系。(2)3個(gè)轉(zhuǎn)基因八棱海棠株系組培苗生根數(shù)極顯著高于轉(zhuǎn)基因株系，其中單拷貝株系極顯著高于雙拷貝株系；轉(zhuǎn)基因株系根長(zhǎng)極顯著短于對(duì)照植株，其中單拷貝株系極顯著短于雙拷貝株系；轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照植株根粗之間均無(wú)顯著差異。 5.以3個(gè)不同轉(zhuǎn)rolC基因八棱海棠株系和對(duì)照植株溫室苗的莖尖、葉片和

9、根為試材，用酶聯(lián)免疫吸附法，分別測(cè)定其內(nèi)源細(xì)胞分裂素CTKs(iPAs和ZRs)、生長(zhǎng)紊(IAA)、赤霉素(GA<,1+3>)、脫落酸(ABA)的含量。結(jié)果表明：rolC基因的轉(zhuǎn)入改變八棱海棠植株中各部位內(nèi)源激素的含量，但并沒(méi)有改變其分布情況。3個(gè)株系轉(zhuǎn)rolC基因八棱海棠植株中內(nèi)源激素變化趨勢(shì)較為一致：各部位的內(nèi)源細(xì)胞分裂素、赤霉紊和脫落酸的含量均比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓陿O顯著提高；根部生長(zhǎng)素含量極顯著提高，而它在莖尖和葉片中含量均極顯著下

10、降。 6.生根組培苗移栽4個(gè)月后，3個(gè)轉(zhuǎn)基因八棱海棠株系株高、節(jié)間長(zhǎng)度、節(jié)間數(shù)均極顯著小于對(duì)照植株，并且單拷貝株系以上各項(xiàng)指標(biāo)極顯著小于雙拷貝株系。利用石蠟切片法結(jié)合光學(xué)顯微鏡，比較它們的莖葉橫切面結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：3個(gè)轉(zhuǎn)rolC基因八棱海棠的葉片長(zhǎng)度、寬度和葉面積顯著小于未轉(zhuǎn)基因植株；對(duì)照植株葉片下表皮氣孔密度極顯著大于rolC基因單拷貝株系33a和20a，和雙拷貝株系20b相比無(wú)顯著差異；轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株的氣孔長(zhǎng)度和寬度均

11、無(wú)顯著差異；對(duì)照植株上/下表皮細(xì)胞密度則極顯著小于3個(gè)轉(zhuǎn)rolC基因株系；轉(zhuǎn)基因八棱海棠葉片的柵欄組織和海綿組織的比例是未轉(zhuǎn)基因植株的1.39-1.48倍；3個(gè)轉(zhuǎn)rolC基因八棱海棠株系的材皮比，導(dǎo)管密度、導(dǎo)管面積以及導(dǎo)管占木質(zhì)部總面積的比例均顯著低于對(duì)照植株。 7.以3個(gè)株系的轉(zhuǎn)rolC基因八棱海棠在無(wú)外界抗性壓力篩選情況下無(wú)性增殖獲得的第1，2，3代繼代苗以及通過(guò)葉片再生獲得的第1，2代再生苗為試材，應(yīng)用PCR、South

12、ern雜交和RT-PCR研究了外源rolC基因在轉(zhuǎn)基因八棱海棠無(wú)性繁殖過(guò)程中的遺傳穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)的穩(wěn)定性。在此同時(shí)，我們對(duì)和rolC基因相關(guān)的植株生根能力和增殖能力的遺傳特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)rolC基因八棱海棠在無(wú)性繁殖過(guò)程中外源rolC基因不僅能夠穩(wěn)定的遺傳，而且能夠在轉(zhuǎn)錄水平上穩(wěn)定表達(dá)。無(wú)性增殖苗和葉片再生苗的生根能力和增殖能力均能獲得穩(wěn)定的遺傳。 8.分別研究了鹽脅迫和低溫脅迫條件下轉(zhuǎn)rolC基因八棱海棠葉