轉(zhuǎn)lgtC基因甜菜糖分分析和轉(zhuǎn)乳糖合成酶基因甜菜的獲得.pdf

1、Globotriose是一種具有重要價值的寡糖。在大腸桿菌中，在外源添加乳糖情況下，它的合成需要3個關(guān)鍵酶基因：（1）susA，編碼Sucrose synthase（EC2．4．1．13）；（2）galE，編碼UDP-galactose4-epimerase（EC5．1．3．2）；（3）ιgtC，編碼α-1，4-galactosyltransferase（EC2．4．1．x）。在植物中，Globotriose因缺少ιgtC酶和乳糖而不能

2、被合成。 ιgtC基因，來自奈瑟氏腦膜炎球菌（Neisseria meningitidis），該酶催化從UDP-Gal上轉(zhuǎn)移一個半乳糖殘基到乳糖末端上。本工作以轉(zhuǎn)ιgtC基因的甜菜植株為材料，研究甜菜細胞糖組分的變化，探求ιgtC基因?qū)D(zhuǎn)基因植株代謝和生長發(fā)育的影響。 為了準(zhǔn)確測定轉(zhuǎn)基因甜菜的可溶性總糖組成和含量，本工作利用薄層層析方法分離和鑒定轉(zhuǎn)基因植株的各種糖分，同時采用高效液相色譜分離和示差折光檢測器測定技術(shù)定量葉

3、片提取液中的蔗糖、葡萄糖和果糖含量，采用反向高效液相色譜分離和光電二極管陣列檢測器測定UDP-半乳糖的含量。 人的乳糖合成酶由二亞基組成，其調(diào)節(jié)亞基為乳清蛋白（α-lactalbumin），由LALBA基因編碼；催化亞基為β-1，4-galactosyltransferase（EC2．4．1．22），由Gal-T1基因編碼，催化從UDP-Gal上轉(zhuǎn)移一個半乳糖殘基到葡萄糖末端上合成乳糖。本工作擬以轉(zhuǎn)ιgtC基因的甜菜叢生芽為受體

4、將LALBA、Gal-T1基因轉(zhuǎn)入甜菜，探討利用轉(zhuǎn)基因甜菜合成乳糖、Globotriose的可行性。 1.轉(zhuǎn)ιgtC基因甜菜糖分的分析 首先用RT-PCR方法篩選出ιgtC基因高效表達的甜菜轉(zhuǎn)基因株系，然后對這些株系進行可溶性總糖、單糖和二糖以及核苷糖測定分析，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)正義基因的株系無論葉中還是塊根中的可溶性總糖含量均較野生型株系顯著提高，相應(yīng)的葡萄糖、果糖和蔗糖含量與野生型株系相比也均有不同程度的提高；轉(zhuǎn)基因株系UD

5、P-半乳糖含量與對照相比顯著降低；而轉(zhuǎn)反義基因株系的可溶性總糖、UDP-糖以及其它糖分含量均與野生型植株無明顯差異。 轉(zhuǎn)基因植株生長發(fā)育觀察和光合作用測定表明，向甜菜中轉(zhuǎn)入來源于原核生物的ιgtC基因未影響植株的生長發(fā)育和光合作用。 2.轉(zhuǎn)乳糖合成酶基因甜菜的獲得 從人的cDNA文庫（Marathon-Ready cDNA）中克隆得到乳糖合成酶基因（LALBA基因、Gal-T1基因），構(gòu)建雙基因串聯(lián)的植物表達載體

6、并轉(zhuǎn)化已有的轉(zhuǎn)ιgtC基因甜菜叢生芽，獲得聚合三個基因的甜菜植株。 建立起四個轉(zhuǎn)，ιgtC正義基因株系的離體叢生芽體系，經(jīng)過繼代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，4個株系L1、L2、L3、L4與WT都有叢生芽發(fā)生，誘導(dǎo)時間相差不大，其中株系L2不定芽的發(fā)生時間較早。培養(yǎng)6周后，不同株系的誘導(dǎo)率均大于86％。隨著叢生芽塊繼代培養(yǎng)時間的延長，不同株系間出現(xiàn)差異。有的株系的單芽在繼代培養(yǎng)過程中增殖迅速，發(fā)生次生芽較多，而有些株系的單芽生長雖快但較少發(fā)生次生芽

7、。 選取ιgtC基因表達活性較高且次生芽增殖迅速的株系L2、L4的叢生芽，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將乳糖合成酶基因引入甜菜，經(jīng)PCR檢測獲得了聚合三個基因（LALBA、Gal-T1、ιgtC）的甜菜植株。 本論文以ιgtC基因和從人cDNA文庫中分離的乳糖合成酶基因為目標(biāo)基因，利用甜菜細胞為受體，獲得了轉(zhuǎn)入單個或數(shù)個目標(biāo)基因的植株，同時研究了轉(zhuǎn)基因植株中糖代謝途徑的改變對糖分積累、生長發(fā)育的影響，為探測甜菜細胞糖代謝途徑調(diào)控機制