轉(zhuǎn)BoTMT基因大豆的獲得及鑒定.pdf

1、生育酚(tocopherol)俗稱維生素E，是僅由光合生物合成的一類脂溶性的強(qiáng)抗氧化物質(zhì)，為人體所必需。在天然存在的4種生育酚中，α-生育酚的生物活性最高且被人體優(yōu)先吸收和利用。植物油是人類膳食中α-生育酚的主要來源，但在大多數(shù)植物油中，α-生育酚含量很低而其生物合成前體γ-生育酚含量較高。例如，大豆油中α-生育酚的含量僅占生育酚總量的7％，而γ-生育酚卻高達(dá)70％，這一現(xiàn)象與α-生育酚合成途徑中γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶(γ-TMT)的活性

2、有關(guān)。本課題組合作單位中國科學(xué)院微生物研究所從結(jié)球甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.captitata)中克隆了γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因的全長cDNA序列(命名為BoTMT)，體外原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明，BoTMT表達(dá)的蛋白質(zhì)具有γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶活性，能有效地催化γ-生育酚甲基化生成α-生育酚。本課題組為培育高α-生育酚水平的轉(zhuǎn)基因大豆，將BoTMT結(jié)構(gòu)基因克隆到質(zhì)粒pBin438中，構(gòu)建了植物組成型表達(dá)載體pBin-TM

3、TL和種子特異性表達(dá)載體p7S-TMTL。 本研究在上述工作基礎(chǔ)上，利用植物組成型表達(dá)載體pBin-TMTL和種子特異性表達(dá)載體p7S-TMTL，以大豆子葉節(jié)為外植體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化大豆，以期獲得α-生育酚含量高的轉(zhuǎn)基因大豆。實(shí)驗(yàn)期間共獲得再生植株330株，其中轉(zhuǎn)p7S-TMTL的203株，轉(zhuǎn)pBin-TMTL的127株。在以上再生植株中，PCR檢測呈陽性的有58株，其中轉(zhuǎn)pBin-TMTL的31株，轉(zhuǎn)p7S-TMTL的27

4、株。通過Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)4株呈陽性反應(yīng)，初步說明BoTMT已整合到大豆的基因組中并有效表達(dá)。在T1代中，有10株P(guān)CR檢測呈陽性，初步證明外源基因已遺傳給后代。上述研究結(jié)果為進(jìn)一步獲得高產(chǎn)α-生育酚的轉(zhuǎn)基因大豆奠定了基礎(chǔ)。 此外，本文還優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)子葉節(jié)轉(zhuǎn)化體系，發(fā)現(xiàn)在種子滅菌時(shí)，氯氣熏蒸滅菌法優(yōu)于升汞滅菌法；比較了吉林小粒1號、H6001、NF58等3個(gè)品種的再生效率，發(fā)現(xiàn)吉林小粒1號的再生能力最強(qiáng)、其次為H