轉(zhuǎn)紫杉二烯合成酶基因青蒿中紫杉烷類物質(zhì)的分析.pdf

1、紫杉醇是一種被FDA批準(zhǔn)用于治療多種癌癥的高效、廣譜的抗癌藥物。目前市場上所用的紫杉醇大多是從原材料紅豆杉中直接提取或者提取紫杉醇合成途徑中含量較多的前體物質(zhì)，然后通過半合成而得來；由于紅豆杉生長緩慢，加上紅豆杉中相關(guān)的物質(zhì)含量極低，現(xiàn)有技術(shù)條件難以滿足市場需求，致使其藥價昂貴，急需尋找新的解決途徑。生物技術(shù)的不斷發(fā)展，為解決紫杉醇等資源短缺問題提供了全新思路。目前，紫杉醇生物合成途徑中的一些關(guān)鍵酶基因已經(jīng)被成功克隆，通過建立紅豆杉遺傳

2、轉(zhuǎn)化體系，采用轉(zhuǎn)基因方法提高這些關(guān)鍵酶基因表達(dá)，有可能改善紫杉醇資源問題。本研究對轉(zhuǎn)紫杉二烯合成酶基因青蒿中紫杉烷類物質(zhì)進(jìn)行了分析。研究結(jié)果如下： ⑴采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)化青蒿葉片，經(jīng)潮霉素篩選，PCR 檢測以及RT-PCR 分析得到了30 株基因在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)了的青蒿植株。 ⑵比較了轉(zhuǎn)基因青蒿植株與野生型青蒿植株的生長情況，從株高、分枝數(shù)、整株干重等農(nóng)藝性狀來看，該基因?qū)τH代青蒿的生長并沒有顯著影響。從種子千

3、粒重來看，轉(zhuǎn)入該基因的青蒿植株有的種子變小，但對發(fā)芽率并沒有多大影響，子代青蒿長勢很好。PCR 檢測了F1代青蒿中該基因的遺傳，表明該基因已經(jīng)穩(wěn)定地遺傳到了子代。 ⑶用GC-MS 檢測了轉(zhuǎn)基因青蒿中的紫杉二烯合成情況，得到了成功合成紫杉二烯的植株；以十九烷為內(nèi)標(biāo)，測得的轉(zhuǎn)基因青蒿中紫杉二烯含量為4.4 ～129.7 mg/kg 干重。比較了不同時期的青蒿中紫杉二烯的含量，發(fā)現(xiàn)生長后期紫杉二烯含量有所提高。比較了青蒿不同部位的紫杉

4、二烯含量，發(fā)現(xiàn)青蒿莖桿中的紫杉二烯含量高于葉片。 ⑷用HPLC-ELSD 測定了不同生長時期轉(zhuǎn)基因青蒿以及野生型青蒿中青蒿素的含量，發(fā)現(xiàn)生長旺盛期產(chǎn)紫杉二烯的青蒿中的青蒿素的含量明顯低于對照野生型青蒿植株。而后期（現(xiàn)蕾至枯萎期）青蒿素的含量在兩者之間差別不大。 ⑸采用文獻(xiàn)報道的紫杉二烯衍生物的質(zhì)譜特征離子為選擇離子，對所得的GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，在轉(zhuǎn)基因青蒿植株中找到了5個差異峰，這5個差異峰在未轉(zhuǎn)基因青蒿中均沒有，