紫杉二烯合成酶及腫瘤血管生成抑制因子基因克隆與轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康的第二大殺手，尋找對腫瘤細胞具有高殺傷力而對正常細胞毒副作用小的新型抗腫瘤藥物，具有非常重要的現(xiàn)實意義。本研究的目的旨在利用赤霉菌中存在的二萜類化合物赤霉素的代謝途徑構(gòu)建能夠表達生產(chǎn)紫杉醇前體的重組赤霉菌，為20世紀人類發(fā)現(xiàn)的最重要的新型抗癌藥物二萜類化合物紫杉醇開辟新的藥源途徑，為緩解藥源短缺對紫杉醇應用范圍進一步擴大造成的嚴重限制提供理論和技術(shù)依據(jù)；另一方面，為新一代抗腫瘤活性分子腫瘤血管生成抑制因子Arr

2、esten尋找安全、有效、廉價、易于推廣應用的蛋白表達生產(chǎn)系統(tǒng)。 Ⅰ采用RT-PCR方法從紅豆杉胚性愈傷組織細胞系E3B中克隆紫杉二烯合成酶基因全長cDNA。將可以在大腸桿菌BL21s中表達、序列正確的紫杉二烯合成酶基因全長cDNA引入表達載體pAN52-1Not的起始密碼子ATG下游，并將選擇標記潮霉素B抗性表達框引入pAN52-1Not完整轉(zhuǎn)錄單位的側(cè)翼區(qū)域，獲得紫杉二烯合成酶基因cDNA表達載體pANts-hyg。

3、 Ⅱ采用PCR擴增法從赤霉菌基因組中克隆了赤霉素生物合成途徑中第一個特異性關鍵酶——內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶基因cps的部分序列作為同源片斷，以平端連接的方式引入絲狀真菌表達載體pCSN44的HindⅢ位點，獲得旨在中斷赤霉素生物合成途徑的cps基因打靶載體pCSNcps。 Ⅲ通過單因素實驗建立了本實驗用赤霉菌菌株原生質(zhì)體制備方法。研究結(jié)果表明，以10ml含15％粗制崩潰酶的酶解體系于37℃酶解4h，6個實驗用赤霉菌受試菌株的原生質(zhì)

4、體產(chǎn)量都可以達到106/mL，能夠滿足遺傳轉(zhuǎn)化操作的需要，而使用溶壁酶制備實驗用赤霉菌菌株原生質(zhì)體的產(chǎn)量不足103/mL。 Ⅳ建立了適用于赤霉菌菌株CBS195.34的原生質(zhì)體/PEG法轉(zhuǎn)化體系，通過原生質(zhì)體/PEG轉(zhuǎn)化法獲得少量赤霉菌轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過PCR檢測及Southernblot雜交檢測，證實本研究采用原生質(zhì)體/PEG法以pANts-hyg轉(zhuǎn)化獲得一株基因組整合有紫杉二烯合成酶基因cDNA的赤霉菌轉(zhuǎn)化子和4株pCSNcps轉(zhuǎn)

5、化、潮霉素B抗性水平高于親本菌株的赤霉菌轉(zhuǎn)化子。整合有外源基因的赤霉菌轉(zhuǎn)化子的生長形態(tài)和生長能力與親本菌株相比存在顯著差異。而且，隨著傳代次數(shù)的增加，生長能力明顯下降；用cps基因打靶載體pCSNcps轉(zhuǎn)化赤霉菌的研究結(jié)果表明，簡單的插入型打靶載體，即使攜帶足夠長的同源序列，也不利于通過同源重組方式破壞靶基因cps而致使赤霉素合成中斷的赤霉菌轉(zhuǎn)化子的獲得。 Ⅴ考查了電擊轉(zhuǎn)化和基因槍轉(zhuǎn)化法對于實現(xiàn)赤霉菌遺傳轉(zhuǎn)化的有效性。研究結(jié)果初

6、步表明，不同的赤霉菌菌株，其轉(zhuǎn)化性能差異很大；電擊轉(zhuǎn)化法對提高赤霉菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率沒有明顯效果；采用基因槍法轉(zhuǎn)化赤霉菌菌絲斷片也未獲得比原生質(zhì)體/PEG法更好的結(jié)果。 Ⅵ采用一步法RT-PCR從人胎盤組織中擴增出讀碼框架大小為690bp的腫瘤血管生成抑制因子ArrestencDNA。經(jīng)亞克隆引入植物雙元表達載pCAMBIA1301的NcoⅠ和BstEⅡ位點之間，獲得目的基因植物表達載體pCAMBIAarr并通過凍融法將pCAM

7、BIAarr轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，獲得攜帶目的基因的重組根癌農(nóng)桿菌LBA4404(pCAMBIAarr)。 Ⅶ采用葉盤法以重組根癌農(nóng)桿菌LBA4404(pCAMBIAarr)轉(zhuǎn)化煙草秦煙95，經(jīng)過潮霉素B篩選、PCR及Southenblot雜交檢測，獲得2個轉(zhuǎn)基因煙草再生株，進一步的RT-PCR檢測結(jié)果表明，目的基因在轉(zhuǎn)基因煙草中存在轉(zhuǎn)錄水平上的表達。該結(jié)果同時也驗證了選擇標記的有效性和表達載體在宿主植物中的可用性，為進